实验——志贺氏菌属（Shigella）检验

1 目的

1.1 了解志贺氏菌属系统检验原理

1.2 理解志贺氏菌属生化反应原理

1.3 掌握志贺氏菌属系统检验方法

2 原理

志贺氏菌属的细菌，又称为痢疾杆菌。能引起痢疾症状的病原微生物很多，如志贺氏茵属、沙门氏茵属、变形杆菌属、埃希氏菌属等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫及病毒等，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志贺氏菌的易感性较高，所以在食物和饮用水的卫生检验时，常以是否含有志贺氏茵作为指标。

与肠杆菌科各属细菌相比较，志贺氏菌属的主要鉴别特征为不运动，对各种糖的利用能力较差，并且在含糖的培养基内一般不形成可见气体。除运动力与生化反应外，志贺氏菌的进一步分群分型有赖于血清学试验。

3 材料

3.1 菌种

某种志贺氏菌（Shigella sp.

大肠埃希氏菌（E. coli）

3.2 检样

食品检样

3.2 培养基及试剂

CN增菌液、HE琼脂、SS琼脂、伊红美蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂（TSI）、半固体肉汤蛋白胨试管、赖氨酸脱羧酶试验培养基、苯丙氨酸培养基、西蒙氏柠檬酸琼脂、葡萄糖铵琼脂、葡萄糖半固体、缓冲葡萄糖蛋白陈水、糖发酵管（棉籽糖，甘露糖，甘油，七叶苷及水杨苷）、5%乳糖发酵管、蛋白胨水、尿素琼脂。

氰化钾（KCN）、吲哚试剂、加基红试剂，V-P试剂、氧化酶试剂、志贺氏菌属诊断血清。

3.4 器具

天平（称取检样用）、均质器和乳钵、温箱、显微镜、灭菌光口瓶、灭菌三角瓶、灭菌平皿、载玻片、酒精灯、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、镍铬丝、试管架、试管篓、硝酸纤维素滤膜。

4 流程

 

5 步骤

5.1 增菌

称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食用均质器以8 000～10 000r/m打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8h，培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应终止培养。

5.2 分离

取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板1个，于36℃培养18～24h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。

5.3 生物化学试验

   挑取乎板上的可疑菌落，接种在三糖铁琼脂和半固体各一管。一般应多挑几个茵落

以防遗漏。志贺氏茵属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气(福氏志贺氏茵

6型可微产气)，斜面产碱，不产生硫化氢；半固体管内沿穿刺线生长，无动力，具有以

上特性的菌株，疑为志贺氏菌，可做血清学凝集试验。

    在做血清学试验的同时，应同时做苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏

柠檬酸盐和葡糖胺、尿素、KCN、水杨苷、七叶苷试验，志贺氏茵属均为阴性反应。必要时应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。并用生化试验方法做4个生化群的鉴定。见表5-1

表5-1 志贺氏菌属四个群的生化特性

注：＋阳性；－阴性；－/＋多数阴性，少数阳性；（＋）迟缓阳性；d有不

5.4 血清学分型

挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。先用4种志贺氏菌多价血清检查。如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表5-2。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查（表5-3）。

表5-2  福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原

注：＋凝集；－不凝集；（）有或无。

6 结果

根据实验过程详细记录样品和对照菌种的各项结果，并做出结论报告。

7 思考

7.1 如何检出食品中的志贺氏菌？

7.2 根据培养和生化试验，有否检出志贺氏菌？

7.3 根据生化特性和血清学试验，检出的志贺氏菌属哪个群？哪个型？