实验——酱油种曲孢子数及发芽率的测定

一 酱油种曲孢子数

1 目的

    掌握应用血球计数板测定孢子数方法。

2 原理

    种曲是成曲的曲种，是保证成曲的关键，是酿制优质酱油的基础。种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，必须达到6×109个/g（干基计）以上，孢子旺盛、活力强、发芽率达85%以上，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。测定孢子数方法有多种，本实验采用血球计数板在显微镜下直接计数，这是一种常用的细胞计数方法。此法是将孢子悬浮液放在血球计数板与盖片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室中的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的孢子数目来计算单位体积的孢子总数。

    实验中，称样时要尽量防止孢子的飞扬。测定时，如果发现有许多孢子集结成团或成堆，说明样品稀释未能符合操作要求，因此必须重新称重、振摇、稀释。生产实践中应用时，种曲通常以干物质计算。

3 材料

3.1 样品

    酱油种曲

3.2仪器和器具

盖玻片，旋涡均匀器，血球计数板，电子天平，显微镜。 

3.3 试剂

    95%酒精，稀硫酸（1∶10）。

4 流程

    曲种→称量→稀释→过滤→定容----制记数板----计算？

5 方法 

5.1样品稀释

    精确称取种曲1g（称准至0.002g），倒入盛有玻璃珠的250ml三角瓶内，加入95%酒精5ml、无菌水20ml、稀硫酸（1:10）10ml，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用三层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不含孢子，最后稀释至500ml。

5.2制计数板

    取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子稀释液1小滴滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。

5.3观察计数

5.3.1 观察

    用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。

5.3.2 计数

    使用16×25规格的计数板时，只计板上四个角上的4个中格（即100个小格），如果使用25×16规格的计数板时，除计四个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即80个小格）。每个样品重复观察计数不少于2次，然后取其平均值。

5.4计算

（1）16×25的计数板  

孢子数（个/g）=(N/100) ×400×10000×(V/G)=4×10⁴×(NV/G)…………（1）

                       式中  N——100小格内孢子总数 （个）

                             V——孢子稀释液体积 （ml）

                             G——样品重量  （g）

（2） 25×16的计数板

孢子数（个/g）=(N/80) ×400×10000×(V/G)=5×10⁴×(NV/G) …………………………（2）

                       式中  N——80小格内孢子总数 （个）

                             V——孢子稀释液体积 （ml）

                             G——样品重量 （g）

5 流程

曲种→称量→稀释→过滤→定容→制计数板→观察计数→计算

6 结果

    样品稀释至每个小格所含孢子数在10个以内较适宜，过多不易计数，应进行稀释调整。结果记入下表。

计算次数    各中格孢子数    小格平均孢子数    稀释倍数    孢子数

（个/g）    平均值

第一次                    

第二次                    

7 思考

用血球计数板孢子计数有什么优缺点？

二 孢子发芽率测定法

1 目的

  学习孢子发芽率的测定方法

2 原理

    测定孢子发芽率的方法常有液体培养法和玻片培养法，部颁标准采用玻片培养法。本实验应用液体培养法制片在显微镜下直接观察测定孢子发芽率。孢子发芽率除受孢子本身活力影响外，培养基种类、培养温度、通气状况等因素也会直接影响到测定的结果。所以测定孢子发芽率时，要求选用固定的培养基和培养条件，才能准确反映其真实活力。

3 材料

3.1 样品

    种曲孢子粉

3.2 培养基

    察氏液体培养基

3.3 仪器和器具

    载玻片、盖玻片、显微镜，接种环，酒精灯，恒温摇床

4 流程

种曲孢子粉→接种→恒温培养→制标本片→镜检→计数

5 方法

5.1 接种  

    用接种环挑取种曲少许接入含察氏液体培养基的三角瓶中，置于30℃下摇床振荡恒温培养3—5 h。

5.2 制片

    用无菌滴管取上述培养液于载玻片上滴一滴，盖上盖玻片，注意不可产生气泡。

5.3 镜检

    将标本片直接放在高倍镜下观察发芽情况，标本片至少同时做二个，连续观察两次以上，取平均值，每次观察不少于100个孢子发芽情况。

54 计算

    发芽率（%）=A/（A+B）×100

        式中   A——发芽孢子数 （个）

               B——未发芽孢子数 （个）

6 结果

6.1正确区分孢子的发芽和不发芽状态。

6.2培养前要检查调整孢子接入量，以每个视野含孢子数10—20个为宜。

6.3 实验结果记入下表

 

孢子发芽数（A）    发芽和未发芽孢子数（A+B）    发芽率（%）    平均值

                   

7 思考

影响孢子发芽率的因素有哪些？哪些实验步骤容易造成结果误差？