副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS) 引起猪的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为猪革拉斯氏病（Glasser’s disease）。近年来，副猪嗜血杆菌引起的疾病已逐渐成为危害世界养猪业的重要疾病^[1]。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5-8周龄的猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%^[2]。随着我国规模化、集约化猪场的发展，副猪嗜血杆菌已在我国出现流行趋势，许多地区都有该病发生的报道 ^[3,4]。笔者对潍坊地区1个猪场疑似猪格拉泽氏病的病例进行了病原的分离鉴定和药敏试验，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1 病料：在无菌操作条件下取疑似病猪的肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液和脑组织等。

1.1.2 培养基：巧克力琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）。

1.1.3 生化试验试剂：氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.4 药敏试纸：头孢菌素、丁胺卡那霉素、氟甲砜霉素、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻肟、红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素, 均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.2　方法

1.2.1 病理变化观察

剖检发病仔猪，观察肺等组织的病理变化。

1.2.2 触片镜检 

肺组织、心血、胸水和腹水触片，镜检。

1.2.3 细菌分离培养

无菌取肺病变组织、心血、腹膜和胸水划线接种巧克力琼脂平板和TSA平板。置37℃培养48h。观察结果。后挑取单个菌落，再进行纯培养。

1.2.4 生化试验

挑取纯化菌落接种于氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等生化鉴定管中，同时加入0.01%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5μl，置于37℃5%的CO₂ 培养箱培养48h，观察结果。

1.2.5 药敏试验

将TSA纯培养物，吸取0.2mL均匀的涂布在TSA平板上，再把药敏试纸贴在TSA平板上，置37℃5%的CO₂培养箱中培养48h，测量抑菌环直径并判定结果。

2　结果 

2.1 剖检变化观察

剖检病死猪,发现胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物；肺脏呈纤维素性胸膜肺炎, 肺臌胀, 暗紫红色,表面覆有纤维素性渗出物；支气管内有淡红色泡沫样渗出物；心包积液；腹腔内有大量透明黄褐色渗出液, 有的呈胶胨状凝块；全身淋巴结肿大,暗红色。

2.2 触片镜检

取发病猪的肺组织、心血、胸水和腹膜面涂片，革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性的细小杆菌，个别两极球杆状革兰氏阴性菌。

2.3细菌的分离培养

无菌取发病猪的肺脏、腹膜、胸水和心血划线接种TSA平板，置37℃，5%CO₂培养箱培养48h，出现无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐的针头大小小菌落，镜检可见大小不一、形态有细长、丝状的革兰氏阴性杆菌。接种无NAD的TSA不生长。

2.4生化鉴定

挑取细菌分别接种于生化鉴定管中,生化试验结果如下。

注：“-” 阴性；“+” 阳性 

2.5 药敏试验

　将纯化培养的细菌接种于鲜血琼脂平皿, 用纸片法进行药敏试验，37℃培养24 h观察。结果该菌对氟甲砜霉素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、磺胺间甲氧嘧啶、头孢噻肟高敏，对红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素低敏。

3　讨论

3.1 通过对该猪场流行病学调查，临床上可初步诊断该病由副猪嗜血杆菌引起。为了鉴定该菌，在试验室进行了分离菌的形态特征观察、培养特性和生长特性观察、生化反应等方面的实验，进一步确诊为副猪嗜血杆菌。通过药敏试验也为下一步副猪嗜血杆菌病的治疗提供了依据。

3.2 副猪嗜血杆菌在病料中的分离率比较低，一般患病猪死亡12小时后，在病料中几乎分离不到，因此需在患猪剖杀或死亡12小时内及时进行病原分离。而且副猪嗜血杆菌对营养要求苛刻，其在巧克力培养基上培养48h生长也较差。一般该菌的分离应采用含NAD、酵母浸出液和10%马血清的TSA培养基。此外，目前各猪场在实际生产中广泛使用抗生素，也是副猪嗜血杆菌分离率比较低的原因之一。