沙门菌属和志贺菌属检验

　　1．掌握沙门菌属和志贺菌属细菌的形态及染色特性、生化反应、培养方法及鉴定意义。

　　2．掌握沙门菌属和志贺菌属细菌的血清学鉴定方法。

　　3．掌握肥达试验的原理、操作方法及结果判断。

 

　　1．菌种 福氏、宋内志贺菌、伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌。

　　2．培养基 SS平板、中国蓝、EMB、MAC、KIA、MIU、硝酸盐培养基。

　　3．试剂 氧化酶试剂或氧化酶纸片、3％过氧化氢溶液、柯氏试剂、甲基红试剂、400g/L KOH、志贺菌诊断血清(包括志贺菌属四种多价血清及福氏、宋内志贺菌单价血清)、沙门菌A～F菌体(O)多价和O及H因子血清；伤寒沙门菌O、H诊断菌液、乙型副伤寒沙门菌H诊断菌液、伤寒或副伤寒患者血清或模拟标本，免疫血清。

　　4．其他清洁载玻片、革兰染色液、生理盐水等、试管、40孔试管架、lml吸管、5ml吸管、无菌滴管、洗耳球、37℃或45℃水浴箱等。

 

　　1．形态观察

　　　(1)革兰染色：沙门菌属细菌为革兰阴性细长杆菌。志贺菌属细菌为革兰阴性杆菌，散在分布。

　　　(2)观察鞭毛染色标本片：镜下可见沙门菌属细菌具有周鞭毛。志贺菌属细菌无鞭毛。

 

　　2．菌落观察

　　　(1)沙门菌属：将本菌接种在SS、MAC平板上经35℃孵育18～24h。由于本菌不分解乳糖并产碱，故在SS和MAC平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落，产生H2S的菌落可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。

　　　(2)志贺菌属：将本菌接种在SS和MAC平板上经35℃孵育18～24h。由于志贺菌不分解乳糖，宋内志贺菌某些菌株可迟缓发酵乳糖，故其在SS平板和MAC平板上形成无色透明的、中等大小的菌落。除宋内志贺菌菌落外均为光滑型菌落。

 

　　3．生化反应

氧化酶试验：方法同大肠埃希菌。沙门菌属和志贺菌属细菌氧化酶试验均为阴性。初步试验鉴定：挑取志贺菌和沙门菌的单个菌落分别接种在KIA、MIU和硝酸盐培养基上，经35℃孵育18～24h，同时做触酶试验。其结果见表2—4。

表2-4 志贺菌属和沙门菌属的基本生化反应

	KIA				MIU			氧化酶	触酶	硝酸盐还原
	斜面	底层	产气	H2S	动力	吲哚	脲酶
志贺菌	K	A	-/+	-	-	+/-	-	-	+	+
伤寒沙门菌	K	A	-	+/-	+	-	-	-	+	+
乙型副伤寒菌	K	A	+	+	+	-	-	-	+	+

 

最终鉴定：须做全面生化反应和血清学试验。

 

　　 4．血清学试验

　　　(1)志贺菌属的分型鉴定：凡生化反应符合志贺菌属者均需做血清学鉴定。取1环志贺菌四种多价血清于载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。结果：对照呈均匀混浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A、B、C、D群最常见的单价血清凝集定种。

 

　　　结果判断、解释和报告：

　　　　①分离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未分离到志贺菌属细菌”。

　　　　②经分离鉴定后符合鉴定依据者，可报告“分离出××志贺菌”，若进一步做多种生化反应及因子血清分型后，可报告：“分离出××志贺菌×型”。

 

　　　(2)沙门菌属的分型鉴定：如果生化反应及形态学检查疑为沙门菌，可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集。首先选用A～F组多价“O”诊断血清做玻片凝集试验。在试验时应以生理盐水作对照。血清凝集试验在5～10min内不出现凝集者可确定为阴性。但若生化反应比较典型，应考虑选用Vi凝集试验。若凝集，则用无菌生理盐水将菌洗下，制成浓厚的悬液，加热100℃、30min，再与A～F组多价“O”诊断血清做凝集试验。若与A～F组多价“O”血清发生凝集，应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片凝集试验，以确定该菌株属于哪一组。一般先选用本地区检出率最高菌型的相应血清做玻片凝集反应。

　　　若已确定哪一沙门菌种后，再分别先用H因子血清检查第I相抗原，然后检查第Ⅱ相抗原，最后确定该菌种属于哪一型沙门菌。

 

　　　结果判断、解释和报告：

　　　　①分离培养未发现可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌鉴定依据者，可报告“未分离出沙门菌”。

　　　　②生化反应符合沙门菌、玻片凝集试验结果阳性，可初步报告为：“分离到××沙门菌”，或“×群沙门菌”。

 

　　5．肥达试验

　　　(1)原理：用已知的伤寒沙门菌O、H抗原，甲、乙型副伤寒沙门菌的H抗原(PA、PB)与肠热症患者血清做定量试管凝集试验，以出现“2+”凝集的最高血清稀释度为效价，测定相应抗体含量，用以辅助诊断肠热症。

　　　(2)试验方法：为单管稀释法。准备4排小试管，每排7支并标记，另取中号试管1支，加生理盐水3．8ml及被检血清O．2ml，混匀，即为1：20稀释，总量为4ml。然后取出2ml按每管0.5m1分别放人各排小试管中的第1支试管中。再于上述中号试管内加生理盐水2ml混匀，此种血清即为1：40稀释，吸取此稀释度血清2ml，按每管0.5m1分别加到各排小试管中的第2支试管中。以此类推连续稀释到各排小试管第6支试管为止，第7支小试管只加入0.5ml生理盐水做阴性对照。然后按表2-5操作。

表2-5血清学试验(肥达试验)方法

	试验管(每管0.5ml稀释血清)						对照管
	1：20	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	生理盐水
O抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
H抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
PA抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
PB抗原	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
血清最终稀释	1：40	1：80	1：160	1：320	1：640	1：1280	-

　　

　　　振荡片刻，置于45℃水浴箱中2h或37℃水浴箱4h，取出置室温或放冰箱中过夜，次日观察并记录结果。

 

　　　(3)结果判断解释和报告：先观察对照管，正确结果应无凝集反应，再分别与对照管比较观察各试管凝集情况。根据液体透明度和凝集块多少，以4+、3+、2+、+、-符号记录。

　　　4+：上清液完全澄清，细菌凝集块全部沉于管底。

　　　3+：上清液澄清度达75％，大部分细菌凝集成块沉于管底。

　　　2+：上清液澄清度达50％，约50％细菌凝集成块沉于管底。

　　　+：上清液体混浊，管底仅有少部分细菌凝集成块，上清液澄清度仅有25 ％。

　　　-：液体均匀}昆浊，无凝集块。

 

　　　以呈现2+凝集现象的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。一般认为，伤寒沙门菌O抗体凝集价在1：80以上，H抗体在1：160以上，甲、乙、丙型副伤寒沙门菌凝集价在1：80以上才有诊断意义。

 

　　1．加入诊断菌液时，由对照管开始往前，每管各加O．5ml。

　　2. 结果观察时不要振荡试管，先观察，必要时再轻摇试管使凝块从管底升起，最后按液体的清浊，凝块的大小进行记录，对照管(不凝集)与试验管同时对着光线往暗处看液体透明度和凝集块。

　　3.“H”凝集呈絮状，以疏松之大团铺于管底，轻摇试管即能荡起，而且极易散开。

　　4．“O”凝集呈颗粒状，以坚实凝片沉于管底，轻摇试管不易荡起，且不易散开。