麻疯树提取物体外抗病毒和杀菌作用的初步研究

【摘要】  　　目的研究麻疯树提取物的体外抗病毒和杀菌作用，为进一步提取分离有效成分提供实验依据。方法采用细胞培养技术，观察麻疯树1，2，3号提取物对单纯疱疹Ⅰ型病毒（HSV-Ⅰ）、单纯疱疹Ⅱ型病毒（HSV-Ⅱ）和流感A3型病毒（A3）的直接灭活作用以及抑制它们增殖的作用；采用悬液定量杀菌法，观察麻疯树1号提取物对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭作用。结果麻疯树1，2，3号提取物对细胞的毒性较小；提取物既能抑制单纯疱疹病毒在胞内的增殖，又能直接灭活该病毒；总体而言，提取物对HSV-Ⅰ在胞内增殖的抑制作用略优于HSV-Ⅱ，对HSV-Ⅰ的直接灭活作用更是显著强于HSV-Ⅱ；提取物对A3的直接灭活作用效果显著；3号提取物还能抑制A3在鸡胚内的增殖。麻疯树1号提取物对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有极强的杀灭作用。结论麻疯树提取物具有体外抗病毒、杀菌的作用。

【关键词】  麻疯树 提取物 抗病毒 杀菌

　　Abstract：ObjectiveTo provide an experimental evidence for further extraction  and separation of active components, we investigated the antivirus and bactericidal effects of extracts from Jatropha curcas L. in vitro. MethodsWe applied the method of cell culture to observe extracts from Jatropha curcas L., No.1,2,3, directly killing herpes simplex virus (HSV-Ⅰ&Ⅱ) and influenza virus A3, as well as inhibiting their proliferation in cells. In another experiment, we observed the bactericidal effect of No.1 extract from Jatropha curcas L. on Candida albicans, Staphylococcus aureaus and Escherichia coli.  ResultsThe extracts from Jatropha curcas L., No.1,2,3, had lower cytotoxicity. All the extracts could inhibit herpes simplex virus from proliferating in cells and directly kill the virus. Their inhibitory action on the proliferation of HSV-Ⅰwas a little better than Ⅱ, while their inhibitory effect on HSV-Ⅰwas obviously stronger than Ⅱ. All the extracts were able to kill influenza virus A3 directly, and extract No.3 could inhibit the proliferation of this virus in embryonated egg. Furthermore, No.1 extract had a very strong bactericidal effect on Candida albicans, Staphylococcus aureaus and Escherichia coli.ConclusionExtracts from Jatropha curcas L. have antivirus and bactericidal effects in vitro.

　　Key words：  Jatropha curcas L.；  Extracts；  Antivirus；  Bactericidal

    

　　麻疯树Jatropha curcas L.，又名黄肿树、芙蓉树、假花生、亮桐、吗哄罕、桐油树、南洋油桐，属于大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属Jatropha植物，主要分布于热带和亚热带地区［1］。麻疯树全身皆可入药，根、茎皮和叶外用具有消肿散淤、止血、杀虫止痒的功能［2～4］，可用于跌打肿痛、创伤出血、皮肤瘙痒、湿疹等；茎叶内服还可以治疗胆结石［2，5］；另经临床试验证明［6］，其乳汁具有抗病毒作用。近年来还发现麻疯树种子具有显著的抗癌活性［7］。由此可见，麻疯树作为一种新兴的资源植物，在新药开发方面具有巨大的应用价值。

　　1  材料

　　1.1  细胞非洲绿猴肾（Vero）传代细胞，由中国中医科学院西苑医院基础研究中心病毒室提供。

　　1.2  鸡胚九日龄鸡胚，购自中国农业科学院。

　　1.3  病毒单纯疱疹Ⅰ型病毒株（HSV-Ⅰ）、单纯疱疹Ⅱ型病毒株（HSV-Ⅱ) 和流感A3型病毒株（A3），由中国预防医学科学院病毒所提供。HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ经Vero细胞增毒后，分别收集，备用。A3经九日龄鸡胚增毒后，其红细胞凝血效价为1∶160，收集，备用。

　　1.4  菌种白色念珠菌（Candida albicans，ATCC10231）第5代培养物，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus，ATCC6538）第4代培养物，大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC8099）第4代培养物，均由四川省疾病预防控制中心提供。

　　1.5  药物麻疯树提取物：麻疯树干叶60%乙醇的浸提液，经低压浓缩并冷冻干燥后制得黑褐色粉末，编为1号，含生药10 g/g。以上述浸提液为原料，以大孔树脂吸附层析法进行梯度洗脱，收集30%和50%乙醇洗脱的产物，经低压浓缩并冷冻干燥后制得粉末为黄绿色和棕黄色，对应编为2号和3号，分别含生药33 g/g和100 g/g。阿昔洛韦滴眼液，1 mg/ml，武汉五景药业有限公司生产，批号为07010904。病毒唑注射液，100 mg/ml，宜昌三峡制药厂生产，批号为20070311。

　　1.6  仪器与试剂96孔细胞培养板；CO2孵箱（日本Yamato 科学株式会社）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂，型号：1833670）；微孔滤器。DMEM干粉培养基（美国Invitrogen公司，批号：1290007）、胎牛血清、吐温。细胞生长液（含10％胎牛血清）、维持液、消化液以及胰酶液（含2％胎牛血清）等按《医学病毒学基础及实验技术》［8］配制。胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）、磷酸盐缓冲液（PBS）等按《消毒技术规范》［9］配制。

　　2  方法与结果

　　2.1  药物体外抗单纯疱疹病毒（HSV）实验［8］

　　2.1.1  HSV对Vero细胞的毒力测定将长成单层的Vero细胞用胰酶液消化成单个细胞，以细胞生长液调整细胞数至8.0×104ml。按每孔0.1 ml加入96孔细胞培养板内，放在37℃，5%CO2孵箱中培养24 h。待96孔细胞培养板内的Vero细胞长成单层后，取上述制备好的HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ毒株，用维持液将其分别做10倍系列稀释(10-1～10-10)，然后按0.1 ml/孔接种于细胞培养板内的Vero单层细胞中，每浓度6个复孔，同时设细胞对照。置37℃，5%CO2孵箱中培养7 d，每日观察并记录细胞病变（cytopathic effect，CPE），测定组织细胞半数感染量(TCID50)。结果见表1。表1  单纯疱疹病毒的毒力测定（略）

     按照Reed-Muench氏法［8］计算，HSV-Ⅰ和HSV-Ⅱ的TCID50分别为10-4.6/ml和10-3.7/ml。在“2.1.3”和“2.1.4”项实验中，所用病毒液浓度为100 TCID50/0.1ml。

　　2.1.2  药物对Vero细胞的毒性实验用维持液分别将1，2，3号药物作系列倍比稀释，药液浓度梯度为2，1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25 mg/ml，加入96孔细胞培养板的Vero单层细胞中，0.1 ml/孔，每实验组4个复孔，同时设细胞对照和阿昔洛韦对照（阳性对照）。置37℃，5%CO2孵箱中培养，观察CPE，并记录各药物的最大无毒浓度（TC0），共7 d。最后，按照Reed-Muench氏法［8］计算出各药物的半数有毒浓度（TC50）。

　　经观察，各药物对细胞的毒性都较小。计算得知麻疯树1，2，3号提取物的TC0和TC50依次为： 0.25 mg/ml和0.56 mg/ml；0.25 mg/ml和0.53 mg/ml；0.125 mg/ml和0.14 mg/ml。

　　2.1.3  药物对HSV在细胞内增殖的抑制作用将100 TCID50/0.1 ml的HSV-Ⅰ接种于96孔细胞培养板的Vero单层细胞中，0.1 ml/孔，置37℃孵箱内吸附1 h。同时，以TC0为各药的起始浓度，将1，2，3号药物作系列倍比稀释，备用。待病毒吸附后，取出孵箱内的细胞培养板，倒掉其中液体，用维持液洗两次，再分别加入预先稀释的各药液，0.1 ml/孔，每个实验组4个复孔，同时设细胞对照、病毒对照以及阿昔洛韦对照。置37℃、5%CO2孵箱中培养，每日观察CPE，当病毒对照组的CPE达“++++”时，（注：“－”表示无细胞病变； “+”表示有25%细胞病变；“++”表示有50%细胞病变；“+++”表示有75%细胞病变；“++++”表示有100%细胞病变。）终止实验。按照上述方法，以HSV-Ⅱ进行相同实验操作。结果见表2。并根据Reed - Muench 氏法［8］计算出1，2，3号药物对不同病毒的EC50 (半数有效浓度) ，以治疗指数(TI，therapeutic index)来评价药物抑制病毒在细胞内增殖的作用，记为TI1，TI1= TC50/ EC50。结果见表3。表3   麻疯树提取物抑制单纯疱疹病毒增殖的治疗指数（略）

    由表2可见，1，2，3号药物均能抑制HSV在细胞内的增殖。其中1号和2号药物在0.25 mg/ml时能够100%抑制病毒的增殖，而3号药物在0.062 5 mg/ml即可达到完全抑制病毒增殖的作用。由表3可见，药物对HSV-Ⅰ的治疗指数以3号最高，达7.00，1号最低，仅为3.11。此外，1号和3号药物对HSV-Ⅱ的治疗指数相同，均为3.50，略高于2号药物的3.31。总体而言，2号和3号药物对HSV-Ⅰ在细胞内增殖的抑制作用强于对HSV-Ⅱ的抑制作用。表2  麻疯树提取物对单纯疱疹病毒在细胞内增殖的抑制作用（略）

　　2.1.4  药物对HSV的直接灭活作用将预先稀释的1，2，3号药物液（稀释方法同“2.1.3”项）与100 TCID50/0.1 ml的HSV-Ⅰ病毒液等量混合，置37℃温箱内1 h。然后接种于96孔细胞培养板的单层Vero细胞中，0.2 ml/孔，每个实验组4个复孔，同时设细胞对照、病毒对照以及阿昔洛韦对照。再放入37℃孵箱吸附1h。取出，倒掉其中液体，用维持液洗两次后，将维持液按0.1ml/孔加到细胞培养板内，置37℃，5% CO2孵箱中培养，每日观察记录CPE，当病毒对照组的CPE达“++++”时，终止实验。按照上述方法，以HSV-Ⅱ进行相同实验操作。结果见表4。计算出1，2，3号药物对病毒的半数有效浓度，记为EC50。同样以治疗指数来评价药物对病毒的直接杀伤作用，记为TI2，TI2 = TC50/ EC50。结果见表5。表5  麻疯树提取物直接灭活单纯疱疹病毒的治疗指数（略）

　　由表4可见，所有药物都能将HSV直接灭活。1号和2号药物在浓度为0.062 5 mg/ml时能灭活所有HSV-Ⅰ，在0.25 mg/ml时能灭活全部HSV-Ⅱ。而3号药物在0.015 6 mg/ml时能灭活HSV-Ⅰ达100%，浓度达到0.062 5 mg/ml时能完全灭活HSV-Ⅱ。由表5可见，所有药物对HSV-Ⅰ直接灭活的治疗指数显著高于HSV-Ⅱ。在对HSV-Ⅰ的直接灭活中，1号和3号药物的治疗指数较高，为14.00，2号药物的指数略低，为13.25。表4   麻疯树提取物对单纯疱疹病毒的直接灭活作用（略）

　2.2  药物体外抗流感A3型病毒（A3）实验［8］

　　2.2.1  A3对鸡胚的毒力测定取上述制备好的A3，用生理盐水作10倍系列稀释(10-1～10-10)，然后将不同浓度的病毒接种于九日龄鸡胚中，0.1 ml/胚，每浓度4个复胚，同时设空白对照。以蜡封住注射孔，放33℃温箱中培养48 h，然后置于4℃冰箱中过夜，次日取出，取尿囊液，用0.5%鸡红细胞作血凝试验，并计算病毒血凝滴度。

     经计算，病毒致鸡胚半数感染量（EID50）为10-4/ml。在“2.2.3”和“2.2.4”项实验中，所配A3浓度为50EID50/0.1 ml。

　　2.2.2  药物对鸡胚的毒性测定用生理盐水将1，2，3号药物作系列倍比稀释，药液浓度梯度为40，20，10，5和2.5 mg/ml。将不同浓度的药物注入九日龄鸡胚中，0.1 ml/胚，每实验组4个重复，同时设空白对照和病毒唑对照（阳性对照）。以蜡封住注射孔，放33℃温箱中培养48 h后，取出，敲碎蛋壳，观察记录鸡胚的存活情况。

     经过观察，1，2，3号药物对鸡胚的TC0均为20 mg/ml，计算得出它们的TC50依次为28.17，28.57和50 mg/ml。

　　2.2.3  药物对A3在鸡胚内增殖的抑制作用将50EID50/0.1ml的A3接种于九日龄鸡胚中，0.1 ml/胚，放33℃吸附1 h。同时，以20 mg/ml为各药物的起始浓度，用生理盐水将1，2，3号药物作系列倍比稀释，浓度梯度为20，10，5，2.5，1.25和0.625 mg/ml，备用。待病毒吸附时间一到，将稀释好的药物注入鸡胚内，0.1 ml/胚，每实验组4个重复，同时设空白对照、病毒对照和病毒唑对照。以蜡封住注射孔，放33℃温箱中培养48 h，然后置于4℃冰箱中过夜，次日取出，取鸡胚尿囊液，用0.5%鸡红细胞测血凝。结果见表6。计算出1，2，3号药物的EC50 (半数有效浓度) ，并以治疗指数(TI)来评价药物对病毒在细胞内增殖的抑制作用，记为TI3，TI3 = TC50/ EC50。结果见表7。表7  麻疯树提取物对流感A3型病毒的治疗指数（略）

 

    由表6可见，1号和2号药物均不能抑制A3在鸡胚内的增殖，只有3号药物在20 mg/ml时可完全抑制A3的增殖。如表7所示，3号药物对流感A3型病毒的治疗指数为5.66。表6  麻疯树提取物对流感A3型病毒在鸡胚内增殖的抑制作用（略）

　　2.2.4  药物对A3的直接灭活作用将稀释好的1，2，3号药物（稀释方法同“2.2.3”项）与50EID50/0.1 ml的A3等量混合，置33℃温箱中和1 h。然后接种于九日龄鸡胚中，0.2 ml/胚，每实验组4个重复，同时设空白对照、病毒对照和病毒唑对照。以蜡封住注射孔，放33℃温箱培养48 h，然后置于4℃冰箱中过夜，次日取出，取鸡胚尿囊液，用0.5%鸡红细胞测血凝效价。结果见表8。计算出1，2，3号药物的EC50 (半数有效浓度) ，以治疗指数(TI)来评价药物对病毒的直接灭活作用，记为TI4，TI4= TC50/ EC50。结果见表9。表9  麻疯树提取物对流感A3型病毒的中和指数（略）

    由表8可见，1号药物在0.5 mg/ml时能灭活所有A3，2号药物在1 mg/ml时才能将全部病毒灭活，而3号药物在0.125 mg/ml时即可100%灭活病毒。因此，如表9所示，3号药物直接灭活A3的治疗指数高达1 250.00，1号药物次之，为78.25，而2号药物的治疗指数最低，为69.68。表8  麻疯树提取物对流感A3型病毒的直接灭活作用（略）

　　2.3  药物体外杀菌实验［10］

　　2.3.1  菌悬液的配制刮取白色念珠菌的平板培养物, 以胰蛋白胨生理盐水溶液（TPS）稀释成菌悬液。摇匀后，采用活菌培养计数，然后以TPS液稀释至实验所需浓度，1×108～5×108 cfu/ml。按照同样的方法，制备金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的菌悬液。

　　2.3.2  药液的配制取适量1号药物，以无菌蒸馏水配制成浓度为150 mg/ml的溶液。2.3.3  麻疯树根提取物1号的杀菌实验以蒸馏水配制3%的牛血清白蛋白溶液作为有机干扰物质。取一支无菌大试管，先加入0.5 ml白色念珠菌悬液，再加入0.5 ml有机干扰物质，混匀，置 20℃水浴5 min后，用无菌吸管吸取预先配制的药液4.0 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。以同样的方法，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行实验操作。

    以含0.5％卵磷脂＋2％吐温－80的0.03 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.03 mol/L，pH7.2）为中和剂。待实验细菌与药液相互作用1 min后，分别吸取0.5 ml实验菌悬液与药液的混合液加于 4.5   ml 经灭菌的中和剂中，混匀。10 min 后，分别吸取1.0 ml样液，按活菌培养计数法测定存活菌数。重复上述操作，但将实验细菌与药液相互作用时间延长至2 min和3 min，最后再进行活菌计数。同时用TPS液代替药液，进行平行试验，作为阳性对照，其活菌培养计数结果代表菌悬液原有浓度，将其作为计算杀灭对数的初始浓度。所有实验组均在37℃温箱中培养，48 h后观察结果。

     实验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值:

　　杀灭对数值 (KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）－试验组活菌浓度对数值（Nx）

    由表10可见，1号药物对白色念珠菌作用1 min则可达到100%的平均杀灭率，对金黄色葡萄球菌作用1 min后其平均杀灭率为99.77%，继续作用至3 min末则可达到99.77%的平均杀灭率，而对大肠杆菌作用1 min即达到99.98%的平均杀灭率，继续作用至2 min末其杀灭率提高至99.99%，作用时间持续到3 min末其杀灭率仍为99.99%，不再变化。表10  麻疯树提取物1号的杀菌效果（略）

　

　　3  讨论

    单纯疱疹病毒是人体重要致病病毒，能引起口唇疱疹、生殖器疱疹、脑炎及内脏器官的感染。流感病毒所引发的流行性感冒是一种急性呼吸道疾病，具有发病快、传染性强、发病率高的特点，临床症状多为高热、寒战、头痛、全身关节痛等。这两类病毒都严重威胁着人类健康，但至今仍缺乏针对它们的有效抗病毒药物。本研究旨在从植物资源中提取出安全而有效的抗病毒活性成分，从而为上述疾病的临床治疗提供更多更好的选择。

    以上研究表明，麻疯树提取物能有效抑制单纯疱疹病毒的增殖，效果虽不比阿昔洛韦，但对该病毒直接灭活作用效果却明显优于阿昔洛韦。麻疯树提取物还对流感病毒具有显著的直接灭活作用。此外，该提取物还具有强效杀菌作用。综上所述，麻疯树提取物在抗病毒药物以及外用杀菌喷剂的开发方面具有良好的应用前景。

作者：刘娟 雷蕾 唐琳 李昱星 陈放  《时珍国医国药》

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　　［4］宋立人. 中华本草，第4册［M］. 上海：上海科学技术出版社，1999：825.

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