三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的评价

［摘  要］ 目的：评价3种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特异性。方法：临床分离的110株葡萄球菌，经革兰染色、触酶试验、ARIS2X鉴定后，用试管法、玻片法、商品乳胶血凝法（slidex staphkit）和凝固酶基因法，鉴定葡萄球菌和评价凝固酶试验方法。4种方法结果不一致的菌株进行重复试验。用凝固酶基因法作为“金标准”，比较其他3种凝固酶方法的敏感性、特异性。结果：凝固酶基因法能够正确判定葡萄球菌凝固酶；试管法有1株菌鉴定假阴性；玻片法有8株菌假定假阳性，2株假阴性；乳胶血凝法有2株假阳性。试管法、玻片法、乳胶血凝法的敏感性分别为98.53％、97.30％和100％；特异性分别为100％、77.78％和94.44％。玻片法鉴定葡萄球菌凝固酶有9.01％的错误。结论：乳胶血凝法和试管法敏感性和特异性较高，是鉴定葡萄球菌凝固酶试验的好方法，玻片法的特异性较差，可能是由于人血浆中产生的葡萄球菌抗体所致。

 

　　［关键词］ 葡萄球菌；鉴定方法；凝固酶；凝集因子

 

　　The Evaluation of 3 Kinds Methods Authenticating Staphylococci Coagulase

 

　　ZHANG Hongsheng

 

　　(The People Hospital of Anyang City, Anyang，He'nan 455000，China).

 

　　Abstract： Objective Evaluates it's sensitivity and particularity 3 kinds of staphylococci coagulas methods .Methods The method is clinical disjunctive 110 stub staphylococcus, after Gram stainhucker modification, Catalase test, ARIS2X authentication ,using the rube method ,the slide agglutination test method ,the sidex staphkit method and coagulase gene method, to authenticate staphylococci and evaluate coagulase test method. The strain will be test again if the result of 4 kind method are inconsistent. As the Coagulasegene method is a "gold standard", evaluate it's sensitivity and particularity lf the 3 kinds of coagulase methods .Results The Coagrlasegene method can authenticate staphylococci coagulase correctly ;There are 1 strain fake negative result by the tube method; 8 strains fake positive result ,2strain fade negative result by agglutination test method;2 strains fake positive result .It's sensitivity is 98.53％、97.30％and 100％,specificity is 100％、77.78％and 94.44％correspond with the tube method ,the slide agglutination test method, the slidex staph kit method and coagulase gene method. There are 9.01％ wrong result by using agglutination test method authenticating staphylococci. Conclusion It's good method to authenticate staphylococci coagulase test by the slidex staphkit method and the tube method with highly sensitivity and specificity .Otherwise ,the specificity of the slide agglutination test method is lower than the others ,perhaps it caused by staphylococci antibody in human plasm.

 

　　Key words：Staphylococcus;Authenticating method ;Coagulase clumping;Factor

 

　　血浆凝固酶试验是鉴别葡萄球菌的重要试验之一，凝固酶分为两种：游离型凝固酶、结合型凝固酶（凝集因子）。游离型凝固酶常用试管法鉴定，结合型凝固酶常用玻片法鉴定。近年来许多商家生产了各种鉴定凝集因子的试剂，如乳胶血凝试剂［1，2］。本文采用临床分离的110株葡萄球菌，以凝固酶基因法为金标准，评价3种葡萄球菌凝固酶的方法。

 

　　1  材料和方法

 

　　1.1  葡萄球菌来源  110株葡萄球菌分离自本院2004年4月至2005年4月临床患者的血、痰、尿、脓汁等分离、经ARIS2X细菌鉴定仪鉴定。

 

　　1.2  细菌鉴定  所有的菌株均进行革兰染色、触酶、凝固酶、ARIS2X细菌鉴定仪鉴定，方法参考［5］。

 

　　1.3  凝固酶试验  阳性质控菌ATCC 25923，阴性质控菌分离自临床经系统鉴定的表皮葡萄球菌。以下试验设有阳性和阴性对照。方法参考［4，5］。

 

　　1.3.1  试管法  兔血浆用生理盐水稀释4倍，取0.5 ml加被鉴定葡萄球菌数个菌落，混合后放35 ℃孵箱，3 h～4 h记录观察结果；若阴性，然后再放24 h，再观察记录结果。大多数金黄色葡萄球菌4 h内均可凝集，极少部分金黄色葡萄球菌须24 h出结果。

 

　　1.3.2  乳胶血凝法凝集试验  乳胶血凝试剂（slidex staphkit）BioMerieux产品，操作参照说明书。

 

　　1.3.3  玻片法凝集试验  将生理盐水1滴放在玻片上，取菌落数个放在其中混合，然后加1滴血浆，混匀后（1 min内）观察结果。

 

　　1.3.4  凝固酶基因法  采用PCR扩增法，检测凝固酶基因。引物设计：上游引物5'GGCGTTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCA3'，下游引物5'CTCTTTTTTCGCTTGTGCTTCACTTTTTCT3'，由上海生物工程公司合成。从过夜纯培养物中提取DNA，PCR扩增，94 ℃ 40 s，62 ℃ 40 s，72 ℃40 s共35个循环。然后取扩增产物15 μl加到1.5％琼脂糖凝胶中，电泳20 min，溴乙锭染色，紫外灯下观察。在450 bp处出现荧光区带为阳性结果，以上4种方法结果不一致的菌株，都进行重复试验。

 

　　2  结果

 

　　2.1  葡萄球菌鉴定结果  经系统生化鉴定和ARIS2X细菌鉴定仪鉴定68株金黄色葡萄球菌，25株表皮葡萄球菌，6株施莱福葡萄球菌，6株孔氏葡萄球菌，3株溶血葡萄球菌，2株华氏葡萄球菌。

 

　　2.2  凝固酶鉴定结果  以凝固酶基因法为“金标准”，比较3种凝固酶试验的敏感性和特异性，见表1。

 

　　2.3  几种凝固酶试验不一致的结果  几种凝固酶试验不一致的结果经重复试验后，最终不一致的结果见表2。

 

　　表1  三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的结果比较（略）

 

　　表2  四种葡萄球菌凝固酶方法不一致的结果（略）

 

　　3  讨论

 

　　本研究以凝固酶基因法为检测游离和结合凝固酶的“金标准”，评价试管法、玻片法和商品乳胶血凝试验方法的敏感性和特异性。凝固酶因子试验和血浆凝固酶试验是两个不相关试验,两者不能相互替代,也不可相互印证。金黄色葡萄球菌既可产生凝固酶,亦可产生凝集因子。结合型凝固酶又称凝集因子，主要存在于金黄色葡萄球菌里昂葡萄球菌和施莱福葡萄球菌中［6，7］。本次调查中临床分离的施莱福葡萄球菌占葡萄球菌的5.4％，与国内报道近似［3］。检查凝集因子，传统的方法采用兔或人血浆与待测葡萄球菌做玻片凝集试验，该法的缺点是假阳性和假阴性较高，本次调查中有6个表皮葡萄球菌玻片法凝集因子试验阳性，这可能是由于人血浆中产生的自身抗体或血浆中的抗凝剂所致。乳胶血凝法是用提纯IgG的FC段与金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）结合，反应机制是双链式，所以避免了某些金黄色葡萄球菌游离凝固酶或SPA产生不足所致的假阴性；它用于检测凝集因子和蛋白质A的乳胶血凝混合试剂，大大提高了检测凝集因子的特异性。本次试验它是将纯化的纤维蛋白原致敏红细胞表面，特异性单克隆抗体（抗A蛋白）包被乳胶，可排除血浆中某些干扰物质，因而乳胶血凝法准确性佳、操作简单、敏感性强。游离型凝固酶主要存在于金黄色葡萄球菌、中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌中［6，7］。本次调查中未检出中间型葡萄球菌，游离凝固酶阳性的都是金黄色葡萄球菌，因此试管法凝固酶试验鉴定金黄色葡萄球菌敏感性和特异性都是非常好的。但有1株金黄色葡萄球菌游离凝固酶试验阴性，可能是该菌株产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块，或该菌产生的游离型凝固酶不足所致。

 

　　参考文献：

　　［1］  Personne P, Bes M, Lina G, et al. Comparative performances of six agglutination kits assessed by using typical and atypical strains of Staphylococcus aureus［J］. J Clin Microbiol, 1997,35:11381140.

　　［2］  Wllkeraon M,M cAllister S, Miller JM,et al. Comparison of five agglutination tests for identification of Staphylococcus aureus ［J］. Clin Microbiol,1997，35: 148151.

　　［3］  高 霞，李卓成，徐小平.金黄色葡萄球菌凝固酶检测方法的比较评估［J］. 中国感染控制杂志，2005，4（3）：257264.

　　［4］  高屹.如何做好葡萄球菌凝集因子试验［J］.中华医学检验杂志,1999,22(增刊):43.

　　［5］  叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程［M］. 江苏：东南大学出版社，1997：474479.

　　［6］  蔡文城.临床微生物诊断学［M］. 江苏：东南大学出版社，1996：287304.

　　［7］  张桌然，倪语星.临床微生物学和微生物检验［M］. 北京：人民卫生出版社，2003：2838.