动态比浊法定量检测复方氨基酸注射液中的细菌内毒素

【关键词】  复方氨基酸注射液；动态比浊法；细菌内毒素；干扰试验；鲎试剂

 

　　１  材料与方法

 

　　１．１  材料与试剂 

 

　　细菌内毒素检查用水(BET水)(批号030510，规格10　ｍｌ／支，厦门鲎试剂厂)；鲎试剂(动态浊度法鲎试仪专用，批号030725，规格015　ｍｌ／支，厦门鲎试剂厂)；细菌内毒素工作品(批号030610，规格10 EU／支，厦门鲎试剂厂)；复方氨基酸注射液(3AA)批号200304012，200304121，200305093，200305161，200306222，规格250 ｍｌ／瓶，湖北峰江)；BET３２型细菌内毒素测定仪(天津大学无线电厂)；ZH２自动漩涡混合器(天津药典标准仪器厂)；实验所用玻璃器皿经铬酸洗液处理后，再经250℃干烤1h以上，除去外源性内毒素。

 

　　１．２  方法与结果

 

　　１．２．１  实验条件：检测温度为37℃；检测波长为660　ｎｍ；最长检测时间为8400　ｓ。

 

　　１．２．２  细菌内毒素限值(L)的确定［１］：按公式Ｌ＝Ｋ／Ｍ，Ｋ为静脉注射给药的细菌内毒素阈剂量＝50ＥＵ·ｍｌ－１，Ｍ为病人每千克体重每小时最大给药剂量。本文采用家兔热原剂量M＝10ｍｌ·ｋｇ－１·ｈ－１，则复方氨基酸注射液(3AA)细菌内毒素限值(L)为0.5ＥU·ｍｌ－１。

 

　　１．２．３  标准曲线制备及可靠性：取细菌内毒素工作品1支加BET水10　ｍｌ，用封口膜封口，置漩涡混合器上混合15　ｍｉｎ，进行10倍稀释，然后2倍稀释，且各步置漩涡混合器上混合30　ｓ，使其最终内毒素浓度为1.0，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0312，0.0156ＥＵ·ｍｌ－１稀释系列，各取0.15ｍｌ分别加到预先加有0.15ｍｌ鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入浊度仪进行检测。每一浓度平行3管，同时用BET水做2管阴性对照(NC)，结果见表1。表1  标准曲线的可靠性内毒素浓度（略）

 

　　１．２．４  供试品溶液配制及干扰试验：①供试品最大有效稀释倍数(MVD)计算：按公式ＭＶＤ＝Ｌ×Ｃ／λ，Ｌ为复方氨基酸注射液(3AA)的内毒素限值0.5 EU·ｍｌ－１，λ为标准曲线最低浓度0.0156 EU·ｍｌ－１，Ｃ为供试液浓度。当L以EU·ｍｌ－１表示时，C为10 ml·mL-1得样品试验时最大有效稀释倍数(MVD)为32倍。②干扰预试验：将3批复方氨基酸注射液(3AA)用BET水稀释为2、4、6、8倍溶液，每个浓度分别取0.15　ｍｌ加0.15　ｍｌ鲎试剂作为样品检查(Eｔ）；同时另取5管，进行同样倍数稀释，并在各浓度溶液中强化0.125 ＥＵ·ｍｌ－１的内毒素作为样品阳性对照液(Es)，分别取上述各液0.15　ｍl加入预先加有0.15　ｍl鲎试剂的反应管内进行检测，每个浓度重复3管，并设阴性对照，分别测定各浓度样品液及阳性样品的内毒素含量Et和Es，按下式计算回收率(R)。R=(Es－Ｅt)／0.0125×100％，结果见表2。表2  供试品干扰预实验样品批号稀释倍数Et(略）     

   

　　根据中国药典2000年版规定，如果内毒素的回收率在50％～200％之间时，则供试品在该试验条件下不存在干扰因素。表2结果表明，3批供试品在各倍稀释时均无干扰作用，4倍时回收率较好，可作为定量检测的浓度。

 

　　１．２．5  供试品干扰试验与家兔法检查：取5批复方氨基酸注射液用BET水稀释4倍，并制备样品阳性对照，每个浓度重复3管，并做阴性对照，放入检测仪检测，同时进行家兔法检查，结果阴性对照阴性，其他数据见表3。表3  干扰试验样品批号稀释倍数Et(略） 

  　　

　　2  讨论

 

　　实验结果表明，各倍稀释液对鲎试剂不存在干扰作用，4倍可以得到很好的回收率，且动态浊度法进行细菌内毒素定量检测，使用计算机全过程监控，样品反映情况能在显示屏上直观地反映出来，与传统的家兔法相比，避免了动物个体差异及人为判断误差所造成的假阳性或假阴性结果，具有灵敏、简便、结果准确等优点，其检测结果与家兔热原检查结果一致。因此，用动态浊度法检测复方氨基酸注射液(3AA)中细菌内毒素含量是可行的。

作者：宋威 贺德勇   《滨州医学院学报》 2006 年 2 月 第 29 卷 第 1 期

 

　　参  考  文  献

 

 

　　１．　夏振民．药品细菌内毒素检查的限值［Ｊ］．药物分析杂志，１９９５，１５（３）：５４

　　２．　中国药典．二部［Ｓ］．２０００（附录）. 204