沙眼衣原体实验诊断技术进展

　1907年，捷克学者Halberstaeder和Prowazek发现沙眼包涵体，1956年我国学者汤飞凡等分离沙眼衣原体成功，引起了全世界对其进行广泛深入的研究［1］。沙眼衣原体(chlamydia trachomatis, Ct)与人类疾病关系密切，且目前已成为许多国家和地区常见的性传播疾病病原体，日益引起人们重视。Ct感染的诊断决定于病原学检查。随着检测技术的进展，Ct感染的诊断也不断地发生变化。我们就此领域的研究进展作一简述。

 

　　一、细胞生物学检测方法

 

　　1.涂片镜检：Ct寄生于柱状上皮细胞内形成包涵体，取宫颈或尿道标本涂片后，通过碘染色或姬姆萨染色等可见细胞内包涵体。但由于泌尿生殖道中完整细胞较少，以及细胞内包涵体脆性较大，从而造成敏感性过低，不推荐用于临床标本的检查，仅限于Ct的鉴定［2］。

 

　　2.细胞分离培养法：由于Ct的专性细胞寄生性，一般培养法不能使其生长，只有在活的细胞内才能增殖、复制。组织细胞培养法分离Ct多采用McCoy细胞或 Hela-229细胞（国内也有报道采用Hep-2细胞），染色后在显微镜下观察细胞内有无包涵体。早期曾试图用尿标本做培养，但阳性率甚低［3］，只能采用尿道或宫颈拭子。培养法的特异性为100%，但敏感性一般低于100%，且各个实验室操作步骤有所不同，没有标准化，这可能有助于解释对同一种非培养方法的不同评价。组织细胞培养法是诊断Ct感染的“金标准”［4］，但是由于分离培养操作复杂，技术及设备要求高，所需时间长，且敏感性受标本采集、运送、保存等的影响较大［5］，加上国内很多医院不具备细胞培养条件，因而不适于临床应用，多用于科研和疑难病例的终鉴定。

 

　　二、免疫学检测方法

 

　　1.直接荧光抗体测定（DFA）：将针对Ct的单克隆抗体用荧光标记，与标本中的Ct结合后，荧光显微镜检查就能见到发荧光的原体（Ebs）。针对脂多糖（LPS）的抗体荧光不够亮，且染色不匀；而针对主要外膜蛋白（MOMP）的抗体荧光更亮，且减少非特异染色［6］。DFA不象培养法必须存在有活力的Ct，但其敏感性受人群感染率的影响，且有判定结果带有主观性，荧光易淬灭，不适于检测大量标本等缺点。多数学者报道其特异性较高，Hallsworth等［7］报道可达100%，因此在科研中常被用作确证试验。由于此法操作简便、费用低廉，在不具备分子生物学试验条件的医院，可用以检测临床标本［8］，但也需经验丰富者操作。

 

　　2.酶免疫测定（EIA）：用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测Ct的LPS或MOMP，酶反应生成有色产物，用酶标仪进行测定。目前有Chlamydiazyme、ID-EIA、Pharmacia Chlamydia EIA等多种市售诊断试剂盒可供使用。其敏感性从64%到98%，特异性从93%到98%［9］。通常认为，其敏感性在高危人群中可得到满意结果，而在新近感染及治疗监测中敏感性明显下降。EIA的优点在于方法简便、操作自动化，适于短时内大批量标本的检测。但其最大缺点在于，与其他常见微生物产生交叉反应，如金黄色葡萄球菌、A群及B群链球菌、淋病奈瑟菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯菌及其他革兰阴性细菌，从而使特异性达不到100%。国外此法多用于高危人群的筛查，国内应用较少。

 

　　三、分子生物学检测方法

 

　　1.直接检测核酸的技术（即基因探针技术）：此技术利用核酸分子的复性原理，用特定的标记探针去检测标本中的靶核酸。最初为放射性标记，后来逐渐发展为酶或化学发光试剂标记。目前有美国圣地亚哥Gen-Probe公司生产的发光标记基因探针试剂盒PACE-2。与培养法相比，Gen-Probe方法的敏感性和特异性分别为73%～96%和98%～99%［9］，尚无培养法敏感和特异。由于此法成本高、步骤繁琐，随着核酸扩增技术的出现，基因探针技术也就失去了其应用价值。

 

　　2.核酸扩增技术：继基因探针技术之后，很快出现了核酸扩增技术，这些技术包括（1）靶DNA或RNA的扩增，如聚合酶链反应(PCR)，基于转录的扩增(TBA)，自动维持序列扩增(3SR) 以及链置换扩增(SDA)；（2）探针扩增，如连接酶链反应(LCR)，Q-β复制酶的扩增；（3）杂交后信号的扩增，如复合探针和分支DNA探针。其中研究和使用较多的是PCR和LCR，尤其是PCR技术，有学者认为其将对感染诊断引起革命性变化［10］。

 

　　PCR属于一种核酸体外扩增技术，用寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增。PCR每个循环包含变性、退火、延伸3个步骤，在不到2小时内，经过30个循环，在理论上可将最初的靶DNA扩增109倍。最后可用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA。由于先将标本中的核酸特异成分先行扩增复制再行检出，其敏感性较直接检测核酸大大提高。

 

　　目前国内外用于构建引物的衣原体DNA有7.5Kb质粒、MOMP基因（omp1）和16SrRNA基因。诊断试剂盒AMPLICOR Ct PCR已通过食品与药品管理局(FDA)的审批，其扩增靶序列即为质粒DNA。许多研究都已表明，PCR较培养法和EIA法都要敏感［7，9，11］，而且PCR对于有症状或无症状人群同样敏感［3］。但基于不同引物的PCR的敏感性仍有所不同。Roosendaal等［12］的研究表明，质粒引物PCR最敏感，omp1引物PCR最不敏感，16SrRNA基因引物PCR介于两者之间。这可解释为在每个衣原体细胞中DNA拷贝数不同的缘故。虽然omp1引物PCR敏感性较质粒PCR为差，但omp1引物PCR扩增的特异性好，而且Palmer等［13］报道通过巢式PCR，经过2轮扩增，同样能够达到质粒引物PCR的敏感性。并且omp1扩增后，利用限制性片段长度多态性（RFLP）还可对Ct进行基因分型［14］，这对流行病学调查具有重要意义。

 

　　PCR技术不但能检测尿道或宫颈拭子标本，而且可以采用尿标本进行检测。但尿中可能存在扩增的抑制物，从而影响PCR的敏感性。Verkooyen等［15］报道将标本进行预先的加热处理或使用2SP转运培养基可显著降低AMPLICOR Ct PCR对抑制因子的易感性。将临床标本加热处理后10倍稀释亦可在很大程度上防止这种抑制。除了尿中的抑制物会影响PCR的敏感性，导致出现假阴性结果外，PCR的另外一个缺点是由于其本身技术原理的原因，容易造成假阳性污染。

 

　　近年亦有学者应用LCR检测Ct。LCR属于一种探针扩增技术，是依赖靶核酸序列的寡核苷酸探针的连接技术。Abbott LCR-CT诊断试剂盒也已通过FDA的审批。同PCR相比，由于使用两对引物，用LCR检测Ct感染，具有更高的敏感性和特异性［16］。但连接酶价格昂贵，难以在临床普及应用，仅适用于科研，且国内应用较少。

 

　　最新发展的扩增试验是Gen-Probe公司的扩增Ct的转录介导扩增试验（TMA），扩增并检测Ct的rRNA。TMA的一个优点是每个感染细胞中有大量的rRNA。而且操作步骤简便，只是一个恒温过程，不需要变换温度的扩增仪。Crotchfelt等［17］报道TMA检测女性尿标本的敏感性和特异性分别为93.8%和100%，男性尿标本为95.6%和98.7%，提示TMA将成为另外一种能利用尿标本检测Ct的扩增方法。国内尚无采用该法进行检测的报道。

 

　　目前除了发展各种核酸扩增技术，国外学者们又将眼光投向了标本取材方面的改进上。除尿标本外，外阴标本也可能作为一种非侵入性标本而适用于PCR、LCR和TMA等高度敏感的扩增方法，在筛查高危人群中可能会替代侵入性标本［18］。测试外阴涂片标本可以节省用于尿标本离心的时间，而且可以由患者自行取材［19］。另外，为节省时间和费用，有学者尝试，同时进行几种性传播疾病病原体的共同扩增，但结果不尽如人意［20-22］。

 

　　综上所述，结合国内情况，泌尿生殖道Ct感染的实验诊断中，经典的细胞培养方法虽然特异，但耗时长、费用大，且不够敏感，不适于临床开展；免疫学方法简便快捷，在基层医院具有实用性；在具备分子生物学实验条件的医院，由于PCR方法高度敏感特异，可检测各发病率人群，只要严格规范操作，避免假阴性及假阳性结果的出现，可望在Ct感染诊断中常规使用。总之，Ct感染的诊断目前已发展到分子生物学水平，随着科学技术的不断进步，下个世纪有可能利用生物芯片等更新的技术进行检测。我们应密切注视检测技术的发展，以便准确、快速地对Ct感染作出诊断。

 

　　作者：杨婧　张正   中华医学检验杂志  作者单位：100044 北京医科大学人民医院检验科

 

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