金黄色葡萄球菌耐药性研究进展

摘  要

       金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，在空气、土壤和水中广泛存在，在人体皮肤毛囊、皮脂腺管、鼻腔和肠道中也常有本菌存在。医院的医师和护士中鼻腔带菌达到80～100%，而且常为耐药菌株，是医院感染的重要因素[1]。

  Resistance of Staphylococcus Aureus

　　金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，在空气、土壤和水中广泛存在，在人体皮肤毛囊、皮脂腺管、鼻腔和肠道中也常有本菌存在。医院的医师和护士中鼻腔带菌达到80～100%，而且常为耐药菌株，是医院感染的重要因素[1]。金黄色葡萄球菌之所以成为医院感染的致病菌是因为其很容易获得抗生素耐药性。金黄色葡萄球菌对青霉素耐药出现于1994年，仅仅在青霉素使用2年后； 而对甲氧西林耐药出现于1961年，即耐酶青霉素使用1年以后； 万古霉素是治疗MRSA的首选药物，然而1996年日本发现万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(VISA)，2002年和2004年美国又相继报道[2]3例万古霉素高度耐药的金黄色葡萄球菌(VRSA)。万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的出现使细菌感染再次成为非常棘手的临床问题，2003年美国CDC制定了“VRSA/VISA检测和控制指南”，2005年NCCLS药敏试验执行标准中增加了万古霉素耐药金黄色葡萄球菌检测方法，要求各实验室开展对万古霉素耐药菌的监测。

　　一、金葡菌主要耐药类型和耐药机制

 

1. 青霉素耐药金黄色葡萄球菌

 

产生b-内酰胺酶，水解青霉素中有效基团。

 

2. 甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌

 

获得MecA基团，编码产生PBP2a，对b-内酰胺类抗生素敏感性减低。

 

3. 万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌

 

获得万古霉素耐药肠球菌(VRE)的耐药基因，使万古霉素失去作用位点；或是细胞壁增厚，使万古霉素不能到达作用靶位。

　　二、MRSA耐药性研究进展

 

1. MRSA的耐药机制

 

在万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)中含有5种与b-内酰胺类抗生素亲和力高的青霉素结合蛋白(PBP)，即PBP1、PBP2、PBP3、PBP3’和PBP4，总称为PBPs，PBPs具有羧肽酶或转肽酶作用，主要参与细胞壁粘肽层的合成，对于细菌生长繁殖、保持正常形态起重要的作用，是细菌生长、繁殖所必需的。MSSA中PBPs和b-内酰胺类抗生素结合后，酶功能被抑制，使细胞壁合成受阻，导致细菌因不能抵抗外界的渗透压力而死亡。MSSA活动一个耐药基因(mecA)后，即为MRSA。mecA能编码合成一种新的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，PBP2a能执行PBPs的生理功能，但与b-内酰胺类抗生素亲和力低，当有b-内酰胺类抗生素存在时，正常的PBPs与之结合，功能被抑制，而PBP2a不与之结合，则可代替PBPs发挥作用，使细菌能够正常生长，产生耐药性。MecA基因可以在葡萄球菌属间转移和传递，但mecA的起源目前尚不清楚，有研究发现[3]松鼠葡萄球菌的PBP与MRSA的PBP2a有87.8%的氨基酸同源性，推测可能是PBP2a的前体。而在葡萄球菌属以外的其他细菌属中并未发现有mecA的存在。

2. MRSA基因分型及其意义

 

编码PBP2a的mecA基因不是MRSA菌株所固有的，而是一个外来的插入片段，该片段以基因复合体的形式存在，携带mec基因盒(stphylocossal cassette chromosome mec , SCC-mec),SCCmec 基因盒包括两种基因复合体:

 

⑴mec基因复合体: 由编码 PBP2a的结构基因 (mecA)和位于其上游的调节基因(mecR1)和抑制基因(mecI)组成，三者控制着MRSA耐药性的表达程度，其中mecA是耐药性表达的结构基础。在通常情况下，mecI编码的抑制因子(mecI蛋白)结合在mecA基因的启动子部位，使mecA基因不能被转录； mecR1在诱导剂(如b-内酰胺类抗生素)的作用下编码产生诱导因子 (mecR1蛋白)，能够去除 mecI蛋白对mecA的阻遏作用，使mecA转录产生 PBP2a。在MRSA中mecR1和 mecI可以是完整的，也可能是不完整的。根据 mec基因复合体结构，可分为4型，常见的是A和B型，结构特征为，A型:  IS431-mecA-mecR1-mecI； B型: IS431-mecA-mecR1-IS1272 。在mec基因复合体中，IS431的存在有吸引其他耐药基因的功能，使之整合到 SCCmec中，因此MRSA不但对b-内酰胺类抗生素耐药，对其他抗生素也存在抗药性，IS431插入子是染色体内多重耐药基因存放的位点。

 

⑵染色体盒重组基因复合体(cassette chromosome recombinases, ccr)，有两种点特异性重组基因组成，ccrA和ccrB，负责SCCmec基因盒的移动，ccrA和ccrB可分为1、2、3型。

 

根据mec和ccr基因复合体结构，可将SCCmec基因盒分为四型。

 

I型: 由B型mec基因复合体和ccr1型基因复合体组成。多见于早期分离的MRSA菌株，代表株为NCTC10442，是1961年首次从英国分离出的MRSA菌株[4]。在I型中除mecA基因外没有其他耐药基因。

 

II型: 由A型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。是目前医院感染MRSA中常见的基因型，代表株为N315，是1982年从日本分离的MRSA菌株[4]。在II型SCCmec的J区中含有完整的pUB110质粒和Tn554转座子，Pub110与细菌对氨基糖苷类抗生素、卡那霉素、妥布霉素耐药有关，Tn554编码红霉素、壮观霉素抗药性。

 

III型: 由A型mec基因复合体和ccr3型基因复合体组成。也是医院感染MRSA常见的基因型，代表株85/2082，是1985年从新西兰分离的MRSA菌株[4]。在Ⅲ型SCCmec中mecA以外，还含有完整的pT181质粒、Tn554转座子和jTn554。jTn554是编码抗镉的基因，pT181质粒编码四环素耐药、Tn554编码红霉素、壮观霉素抗药性。

 

IV型: 由B型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。是新出现的社区感染MRSA常见基因型，MW2和CA05为Iva 型代表菌株，8/6-3P为Ivb型代表菌株，在IVa 和IVb型SCCmec中除mecA外，不含其他耐药基因。

 

3. 社区感染MRSA(CO—MRSA)

 

CO-MRSA是近年来出现的一种新的耐药模式，在美国、澳大利亚和欧洲引起广泛重视[5]。CO-MRSA多为IVa 或Ivb基因型，仅含mecA基因，与典型的医院感染MRSA(H-MRSA)比较，主要的特征是仅表现为对b-内酰胺类抗生素耐药，而对多种非b-内酰胺类抗生素(如庆大霉素)的敏感性可能增加，甚至仅对青霉素类耐药，对头孢类抗生素也表现为敏感。与H-MRSA比较CO-MRSA的毒性更强，可产生杀白细胞毒素。较多的研究认为，CO-MRSA并非其源于H-MRSA，而是一种新的耐药模式。

　　三、万古霉素耐药金葡菌研究进展

 

1. 概述

 

万古霉素金黄色葡萄球菌一般分为三种: 万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(Vancomycin-Resistant Staphylococcus Aureus, VRSA)、万古霉素中度耐药金黄色葡萄球菌(Vancomycin-intermediate Staphylococcus Aureus, VRSA)和万古霉素异源性耐药金黄色葡萄球菌(Heterogeneous  Vancomycin-Resistant Staphylococcus Aureus, Hetero-VRSA)。VRSA是指临床分离的金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)对万古霉素的MIC≥32mg/l，于2002年在美国首次报道[6]，至今在全世界仅报道三例。VISA指金葡菌对万古霉素的MIC为8～16mg/l ，于1997年由日本学者首先分离出第一株对万古霉素中度耐药的金黄色葡萄球菌(Mu50，MIC=8 mg/l)，随后美国和中国等地又陆续发现多株VISA。hetero-VRSA指从临床标本分离的金葡菌原代纯培养物，万古霉素的MIC≤32mg/l ，但在万古霉素敏感的原代中，存在有部分对较高浓度万古霉素耐药的亚群，这些耐药亚群可以通过一定方法从原代菌株中检测出来，对选择出的耐药亚群做万古霉素MIC测定，浓度可以增加2～8倍。1996年日本首先分离出hetero-VRSA(Mu3，MIC=3mg/l)，此后许多国家相继有报道。

2. 耐药机制

 

(1)耐药质粒传递1992年，Noble成功地将粪肠球菌耐药质粒传递给金葡菌，在实验室内构建成“VRSA”。美国于2002、2004年共分离出3株VRSA，均检测出与万古霉素耐药肠球菌(VRE)一致的VanA基因。金葡菌分泌一种肽，其活性类似于粪肠球菌的性信息素CAM373。Sasha等发现携带有VanA基因的粪肠球菌对这种肽产生反应，通过信息素相关过程把其耐药质粒转移至金葡菌体内。经这种机制获得的耐药，一般呈高水平，MIC值可达到1024mg/l 。

 

2003年Weigel等报道了[7]美国Michigan州一位糖尿病患者足部分离的VRSA基因分析结果，证实其耐药基因来源于共同分离的粪肠球菌，它为VanA基因组所编码，存在于一个 57.9-Kb的多耐药性质粒中，该质粒含有完整的10.8-Kb的Tn1546转座子，Tn1546编码9个多肽，这9个多肽协同作用最终形成D-丙氨酰-D-乳酸，取代了细菌肽聚糖前体中的UDP-胞壁酸五肽的 D-丙胺酰-D-丙氨酸，取消了肽聚糖前体与万古霉素之间原有的氢键结合，并使原来的空间构象发生改变，使万古霉素失去作用位点，导致金葡菌对万古霉素高水平耐药。

 

(2)染色体突变

 

VISA和hetero-VRSA菌株的大量研究中并没有发现VanA， VanB或VanC基因。但是，日本学者认为[8]以克隆型IIA为代表的MRSA比世界其他地区的金葡菌更容易产生对万古霉素耐药的潜能。George等[8]测定了6株分离于美国的VISA，发现他们都属于附属基因调节子II族(Accessory Gene Regulator II，agrII)，并且发现从血液中分离出的MRSA中有56%属于agrII族(n=148)，而仅有24%甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)属于agrII族(n=33)，大量基因分析证实了agr基因点突变引起的功能丧失，更易使agrII型金葡菌发展为hetero-VRSA，故认为hetero-VRSA的产生可能与agrII型功能丧失有关。Wooton等[8]最近比较了10株临床分离的VISA(包括Mu50)，11株hetero-VRSA(包括Mu3)和11株万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌(Vancomycin-Sensitive Staphylococcus Aureus ，VSSA)的17个开放读码框: murA、metB、yibM、atl、opuD、lysP、mutS、uhpT、modA、glpT、odhA、sdh、mrp-homologue、SA2468和ribH。发现Mu50、Mu3和其他VISA、hetero-VRSA菌株中均有不同程度的基因突变，但没有固定的突变位点。故认为金葡菌对万古霉素产生耐药是细菌在抗生素选择压力的不断作用下发生突变所致，该突变不稳定是涉及染色体上多位点的一个逐步逐渐过程，这种过程必须在抗生素持续存在的条件下才能继续。

 

(3)细胞壁增厚

 

Daum在1992年[9]报道了一株在实验室通过耐药平板诱导而对万古霉素敏感性降低的金葡菌，这株金葡菌细胞壁增厚，对溶菌酶敏感性减低，也丧失了噬菌体和荚膜(capsular)分型。日本学者Cui 用透射电镜技术对自7个国家分离的16株VISA进行观察，发现VISA细胞壁平均厚度为31.3nm，而万古霉素敏感菌株VSSA细胞壁的厚度仅为23.4 nm，二者间存在着显著差异。Cui进一步发现: 当VISA对万古霉素恢复敏感后(MIC＜4 mg/l)，它们细胞壁的厚度降低且与VSSA无区别。再用万古霉素对这些恢复敏感性的菌株进行选择，细菌对万古霉素的耐药性又回复至原先水平，同时出现细胞壁的增厚。表明细胞壁增厚是VISA和hetero-VRSA的共同特征，与细菌对万古霉素的MIC水平存在明显的相关性(r=0.908)。Cui认为VISA的细胞壁增厚主要是因为肽聚糖层数的增多，其数量可达到3040层。这种增厚可以通过二种机制，一是过多的肽聚糖的合成，二是减少肽聚糖的脱落。VSSA浆膜表面新生的肽聚糖层取代旧的肽聚糖层，使旧肽聚糖层从细菌表面脱落，而这一过程需要肽聚糖水解酶的参与。但研究发现VISA肽聚糖水解酶的活性显著降低，而导致旧肽聚糖层脱落减少及细胞壁增厚。当其肽聚糖水解酶活性恢复正常时，细胞壁随着变薄且对万古霉素恢复敏感性。

 

细胞壁增厚导致金葡菌对糖肽类抗生素耐药，目前认为有两种可能的机制。一种即“亲和诱捕”，认为增厚细胞壁的肽聚糖层上有大量D-丙胺酰-D-丙氨酸残基，它们可与万古霉素结合，导致大部分药物分子结合在细胞壁肽聚糖外层上，而不能接触肽聚糖合成活性部位，因此细菌不能有效被杀灭。另一种是“阻塞现象”，认为糖肽类抗生素分子首先与细菌表面肽聚糖层上的D-丙胺酰-D-丙氨酸残基结合，阻塞了肽聚糖层的网眼，破坏其网状结构，进而阻止药物向细胞内渗及结合靶位点。上述两种作用机制可单独存在，也可同时起作用。有研究表明，Mu50纯化的每单位重量肽聚糖中，D-丙胺酰-D-丙氨酸残基的含量大约是VSSA株的2.4 倍，细胞壁厚度是VSSA的1.5倍，结合的万古霉素分子是VSSA的3.6 倍。

 (4)糖肽链间交联减少

 

肽聚糖交联减少是金葡菌对万古霉素耐药机制之一。研究发现肽聚糖单体五肽支链上的谷氨酸残基未被酰胺化是导致肽聚糖链间交联减少的主要原因。金葡菌合成肽聚糖有二种途径: 第一种途径以N-乙酰葡糖胺为原料，另一种以葡萄糖为原料。研究发现[10]在VISA中第一种合成途径较VSSA并无差别，而第二种途径却显著增强。在该途径中，金葡菌摄取环境中的葡萄糖并将其转化为6-磷酸果糖，L-谷氨酰胺-6-磷酸果糖转氨酶(Glms)又将6-磷酸果糖转变为6-磷酸葡糖胺过程中十分关键，因为它能提供必需的NH4+。在VISA内，Glms活性较VSSA显著增强，过度消耗了谷氨酰胺，导致肽聚糖单体五肽支链上的谷氨酸残基不能酰胺化，无法为转肽酶提供有效的底物，难以形成有效交联。同时，异常增多的肽聚糖单体结合更多的万古霉素分子，减少其进入浆膜的数量，进而使药物分子不能接触活性靶位。

 

转肽酶是催化交联形成的关键酶，其活性的改变也是肽聚糖链交联减少的原因之一。但是单独减少肽聚糖链交联并不会导致耐药，它必须和细胞壁增厚联合作用时才发挥功效。此外，谷氨酸残基非酰胺化肽聚糖上的D-丙胺酰-D-丙氨酸残基对万古霉素的亲和力较酰胺化的强，这也有助于增加金葡菌的耐药性。

 

(5)青霉素结合蛋白与其耐药性的相关性

 

青霉素结合蛋白(penicillin-binding proteins , PBPs)是存在于细菌细胞内膜上一群能同青霉素和其他b-内酰胺类抗生素蛰合的细菌蛋白，即抗生素作用的靶位点。 Beatroz等[10]以实验室诱导的VISA株为研究对象，就其PBP进行分析表明: 所有耐药菌株PBP2结合青霉素的能力都明显增强，PBP2产量增加，且PBP2产量增加与菌株对万古霉素MIC增加呈正关系(r>0.9)，推测可能PBP2与万古霉素竞争结合肽聚糖前体上的靶位，阻碍万古霉素与靶位结合，导致敏感性下降。PBP4具有D-羧肽酶活性，可以从未形成交联的细胞壁上切除D-丙氨酸残基，避免过多的D-丙胺酰-D-丙氨酰五肽形成，从而保证万古霉素有效地作用于金黄色葡萄球菌。Finan[11]等通过基因敲除及基因替补技术，发现在体外诱导产生的VISA中，PBP4活性较VSSA显著减少，但二者的PBP4结构基因及侧翼序列并无活性区别，推测可能与VISA在最低抑菌浓度的万古霉素作用下编码PBP4的质粒减少有关。研究证实: VSSA的PBP4编码基因突变失活，导致VSSA对万古霉素的敏感性下降且肽聚糖交联减少； 补充编码PBP4的质粒后，细菌的敏感性恢复且肽聚糖交联增加。

 

3. 检测方法

 

由于万古霉素耐药金黄色葡萄球菌感染的严重性，各国政府对此非常重视，2003年美国DCD制定了“VRSA/VISA检测和控制指南”，2005年美国NCCLS文件的药敏试验执行标准中增加了VRSA/VISA的检测方法和判断标准:

 

(1)VRSA/VISA检测方法:

 

①挑取菌落置肉汤或生理盐水中，配制成0.5麦氏管浓度菌悬液，相当于1.5×108CFU/ml 。取10ul滴加于含6g/ml的万古霉素脑心浸液培养基，用棉拭或接种环划将其涂开成10～15mm直径大小的区域； 每块平板最多筛选8株细菌。

 

②使接种物被平板吸收，将平板置35℃空气培养，过夜培养后观察，若无细菌生长，则继续培养，使培养时间满24h。

 

③用反射光，仔细检查是否有菌落或菌膜生长。

 

④如果在筛选培养基上有1个以上的菌落生长，则要确定接种物是否是金黄色葡萄球菌纯培养菌株，并用非自动仪器法检测MIC，可接受的检测方法有: 琼脂稀释法、肉汤稀释法、琼脂梯度扩散法。对MIC≥4mg/l 的菌株要求通知当地CDC或卫生主管部门，同时保存菌种，并送CDC做最终确定。

 

⑤报告: 如果无菌落生长，报告万古霉素敏感；有>1个菌落生长，报告为可能为VISA/VRSA菌株。

 

a. 初筛有>1个菌落生长: 报告为可能为VISA/VRSA菌株；

 

b. 用非自动仪器法检测MIC≥4mg/l : 追加报告为金黄色葡萄球菌，VRSA(或VISA)；

 

c. 通知临床医师和感染科医师和当地CDC或卫生主管部门。

 

⑥注意:

 

a. 每块平板最多可筛选8株细菌，接种时应避免重叠；

 

b. 筛选培养基不能检测金葡菌对万古霉素的耐药水平；

 

c. 革兰阴性杆菌、VRE等也可在筛选培养基上生长，所以在筛选阳性的菌株应重新鉴定。

作者：苏春康*  苏振文*  吴泉明#   *福建省永定县医院检验科，福建 364100 #福建省临床检验中心，福建 350007

 

 

参　考　文　献

 

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