34株多重耐药铜绿假单胞菌的耐药性及β内酰胺酶基因分析

【摘要】  　　目的： 对34株多重耐药铜绿假单胞菌的药敏结果和β内酰胺酶基因进行分析，以指导临床合理用药。方法：用KB法对铜绿假单胞菌进行常规药敏试验，选取34株多重耐药铜绿假单胞菌，并用PCR扩增方法检测其β内酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。结果： 34株多重耐药铜绿假单胞菌对12种常用抗生素的耐药率为20.5%～100%，PCR检测出TEM为44.1%，SHV为11.8%，VEB为5.9%，PER为0%。结论： 我院多重耐药铜绿假单胞菌携带的β内酰胺酶基因以TEM为主。

 

【关键词】  铜绿假单胞菌； β内酰胺酶； 多重耐药

 

　　Analysis on drug resistance pattern and genes of βlactamase

of 34 strains multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa

 

　　ZHANG Hongmei,  YIN Qing,  CHENG Jing

 

　　(1.Department of Clinical Laboratory, Jiangning People′s Hospital,  Nanjing Jiangsu 211100; 2.Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang Jiangsu 212001; 3.School of Medical Science and Laboratory Medicine, Jiangsu University,  Zhenjiang Jiangsu  212013,China)

 

　　［Abstract］Objective: To investigate drug resistance pattern and βlactamase genic of multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa, so as to provide reference for reasonable selection of antimicrobials. Methods： Antimicrobial susceptibility was evaluated by disk diffusion test(KB method). The βlactamase genes: TEM, SHV, VEB, PER carried on multidrug resistant Pseudomonas aeruginosa were detected by polymerase chain reaction method(PCR).  Results： The resistant rates of 34 strains multidrug Pseudomonas aeruginosa to 12 kinds of antimicrobials were from 20.5% to 100%. The positive rate of βlactamase genes TEM, SHV, VEB, PER expression was 44.1%(15/34), 11.8%(4/34), 5.9%(2/34), and 0%.  Conclusion： TEM type βlactamase was the main type of Pseudomonas aeruginosa gene in our hospital.

 

　　［Key words］Pseudomonas aeruginosa;  βlactamase;  multidrugresistant

 

    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)广泛分布于自然界，是临床常见的条件致病菌之一，常引起肺部、泌尿系及烧伤创面感染。近年来PA在医院感染分离菌的分离率居首位，其耐药率不断升高，对多种抗生素表现出固有或获得性耐药，对3类或3类以上抗菌药表现耐药的多重耐药(multidrug resistant，MDR)的PA不断增加［1-5］。为了使临床能有效控制感染，对多重耐药菌耐药特征的研究成了人们关注的热点。现对我院2005年1月～2007年12月间部分多重耐药PA的耐药性及β内酰胺酶基因进行分析，报告如下。

 

　　1  材料和方法

 

　　1.1  材料

 

　　1.1.1  实验菌株的收集与筛选

 

　　收集2005年1月～2007年12月我院临床微生物科分离所得的PA，利用KB法筛选出多重耐药的菌株。根据NCCLS2005年标准进行敏感、中敏、耐药的判断，3类或3类以上抗菌药物耐药的菌株判为多重耐药PA。铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌。共收集了34株，其中痰标本19株、尿标本2株、其他标本13株。全部细菌用法国生物梅里埃公司API鉴定系统鉴定到种。

 

　　1.1.2  仪器和材料

 

　　温箱、低温冰箱、PCR扩增仪和电泳仪等。MullerHinton(MH)琼脂为OXO IDE公司产品。

 

　　1.1.3  抗菌药物纸片

 

　　氨曲南(ATM)、头孢吡肟(FEP)、头孢他啶(CAZ)、头孢哌酮/舒巴坦(SCF)、头孢哌酮、亚胺培南(IPM)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)、妥布霉素、磺胺甲恶唑/甲氧苄氨嘧啶(SXT)，均购自中国药品生物制品检定所。

 

　　1.2  方法

 

　　1.2.1  药敏

 

　　根据NCCLS2005年标准，用KB法对铜绿假单胞菌进行常规药敏试验。

 

　　1.2.2  PCR检测细菌β

 

　　内酰胺酶基因  检测模板提取：挑纯培养细菌菌落少许置入50  μl灭菌水中，置100℃水浴10 min，8 000 r/min 30 s，上清液即为DNA模板液。

 

    根据文献［6］和基因库检索，设计引物序列如下：

 

    TEMP1：5′GAGTATTCAACATTTCCGTGTC3′，

    TEMP2：5′TAATCAGTGAGGCACCTATCTC3′，扩增产物为535 bp；

    SHVP1：5′TGGTTATGCGTTATATTCGCC3′，

    SHVP2：5′GCTTAGCGTTGCCAGTGCT3′，扩增产物为865 bp；

    PERP1：5′ATGAATGTCATTATAAAAGC3′，

    PERP2：5′AATTTGGGCTTAGGGCAGAA3′，扩增产物为978 bp；

    VEBP1：5′CGACTTCCATTTCCCGATGC3′，

    VEBP2：5′GGACTCTGCAACAAATACGC3′，扩增产物为961 bp。引物由上海生工生物工程公司合成。

 

    反应体系为：10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP2 μl，P1和P2各0.5 μl，TaqDNA聚合酶1 U，扩增模板液0.5 μl，反应体系25 μl。热循环参数为：94℃预变性5 min，然后按94℃ 1 min→55℃ 45 s →72℃ 1 min，共35个循环；取反应管内液体5 μl 与1 μl 电泳指示剂混匀，点样于1.2%琼脂糖凝胶，以100 V电压电泳30 min后，EB染色，在紫外光下观察结果。

 

    2  结 果

 

    2.1  34株多重耐药PA药敏结果

 

    34株多重耐药PA对12种常用药物的耐药率由 20.5%至100%，具体结果见表1。表1  34株多重耐药PA对12种常用药物的药敏结果（略）

 

    2.2  PCR结果

 

    PCR结果显示，34株多重耐药PA中，TEM阳性为14株，阳性率为 44.1%；SHV阳性4株，阳性率11.8％；VEB阳性2株，阳性率5.9％；PER阳性率0％。其中有3株同时携带SHV和TEM基因。

 

    3  讨论

 

    多重耐药PA感染是临床抗感染治疗的难点之一，根据对本院近年来分离到的PA药敏结果分析，3类或3类以上抗菌药物耐药的PA感染已呈上升趋势。从药敏结果中可以看到，34株多重耐药PA对12种临床常用抗生素的耐药率在20.5%～100%，对β内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类均显示出较高的耐药性。第三代头孢中头孢他啶是经典的抗PA药物，但耐药菌株增加迅速，本研究显示其耐药率达到50%，亚胺培南的耐药率也达到了73.5%，对一些常规药物几乎全部耐药，符合多重耐药的特征。

   

　　由于PA耐药率的不断升高，耐药机制复杂，以及细菌耐药存在区域性差异，对多重耐药菌耐药特征的研究成了人们关注的热点［7-9］。研究认为，PA对β内酰胺类抗生素耐药的主要机制是产生β内酰胺酶和膜泵出系统的相互作用。β内酰胺酶是细菌产生的酶类,能够破坏渗透入菌体内的β内酰胺类抗生素的活性。β内酰胺酶种类很多，特性各样，按分子生物学分类，可以分为A～D 4类［10，11］，除B类为金属酶外，其他3类的活性位点均为丝氨酸残基。本研究利用PCR方法检测了多重耐药PA携带的A类β内酰胺酶基因：TEM，SHV，PER，VEB。TEM和PER是由质粒介导的，携带TEM的PA对所有的抗假单胞菌的β内酰胺类和氨基糖苷类抗生素耐药，PER被认为是一组新的A类β内酰胺酶基因，决定可转移的对氧亚氨基头孢菌素、氨曲南的耐药性。结果显示，在34株多重耐药PA中，TEM的检出率达到了44.1%，但没有检测出PER，说明我院的多重耐药PA携带的β内酰胺酶基因型以TEM为主。

   

　　SHV和VEB通常是由转坐子或整合子介导的，常在其他肠杆菌科的细菌中检出。本组34株多重耐药PA中，4株携带SHV基因，2株携带VEB基因，两者之间没有重叠。有3株同时携带SHV和TEM基因，说明PA可以同时携带多种β内酰胺酶基因，与其他文献报道相符［9］。

 

PA作为一种常见的条件致病菌，其耐药菌株有随着抗菌药物使用频率的增加而逐年增多的趋势。PA的耐药现状不容乐观，目前NCCLS/CLSI推荐的超广谱β内酰胺酶（ESBLs）的表型初筛及确证实验不适合检测PA是否产ESBLs，用分子生物学的方法可以很好地分析PA中的耐药基因型，为临床工作者更好地控制PA感染和使用抗菌药物提供了依据，同时，也有利于加强实验室对院内感染菌的监控。

 

作者：张红梅，阴晴，成静    作者单位：1.南京市江宁区人民医院检验科，江苏 南京 211100； 2.江苏大学附属医院检验科， 江苏镇江 212001； 3.江苏大学基础医学与医学技术学院， 江苏镇江 212013

 

【参考文献】

  　　［1］Gutiérrez O, Juan C, Cercenado E,et al.Molecular epidemiology and mechanisms of carbopenem resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates from Spanish hospitals［J］.Antimicrob Agents Chemother,2007,51(12):4329-4335.

　　［2］Aloush V, NavonVenezia S, SeigmanIgra Y,et al. Multidrugresistant Pseudomonas aeruginosa: risk factors and clinical impact［J］.Antimicrob Agents Chemother, 2006,50(1):43-48.

　　［3］Reinhardt A, Khler T, Wood P,et al.Development and persistence of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa: a longitudinal observation in mechanically ventilated patients［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2007,51(4):1341-1350.

　　［4］Doi Y, Ghilardi R, Adams J,et al. High prevalence of metalloβlactamase and 16S rRNA methylase coproduction among imipenemresistant Pseudomonas aeruginosa isolates in Brazil［J］. Antimicrob Agents Chemother,2007,51(9):3388-3390.

　　［5］Hocquet D, Berthelot P, RousselDelvallez M,et al.Pseudomonas aeruginosa may accumulate drug resistance mechanisms without losing its ability to cause bloodstream infections［J］.Antimicrob Agents Chemother, 2007,51(10):3531-3536.

　　［6］糜祖煌.铜绿假单胞菌耐药基因及其检测［J］.现代实用医学,2004,16(9):558-560.

　　［7］史伟峰,王玉月,姜庆波，等.多重耐药性铜绿假单胞菌耐药基因及菌株聚类分析［J］.中华医院感染学杂志,2007,17（9）:1057-1060.

　　［8］常东, 蒋伟, 魏华，等.多重耐药铜绿假单胞菌产超广谱β内酰胺酶基因研究［J］.中华医院感染学杂志,2006,16(9):961-964.

　　［9］侯天文,尹晓琳,王永祥,等.同时产PER1 型和TEM1型β内酰胺酶铜绿假单胞菌的检出［J］.中国人兽共患病杂志,2004,20(4):295-298.

　　［10］蒋晓飞,洪秀华,孙景勇,等.多重耐药铜绿假单胞菌超广谱β内酰胺酶分析［J］.中华微生物学和免疫学杂志,2002,22(4):443-446.

　　［11］王家平,王苏建,鲁科峰. 239株铜绿假单胞菌的耐药性分析［J］. 江苏大学学报：医学版, 2004,14(6):482-484.