产ESBLs、ESBLs+AmpC酶的肺炎克雷伯菌检出及其耐药性分析

近年来，随着β-内酰胺类抗生素，尤其是头孢三代类药物的广泛应用，引起产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）、AmpCβ-内酰胺酶（AmpC酶）、ESBLs+AmpC酶等一系列耐药菌株的产生，细菌耐药现象日益严重。为更好地了解我院临床分离菌株中产ES-BLs、ESBLs+AmpC酶肺炎克雷伯菌的检出率及耐药性，对138株肺炎克雷伯菌进行ESBLs、ESBLs+Am-pC酶测定及药敏试验，现将结果报道如下。

    1材料与方法

    1.1材料

    1.1.1试验菌株 138株肺炎克雷伯菌均为我院2003年8月～2004年8月住院及门诊病人感染标本中分离的菌株，根据临床资料去除重复菌株。

    1.1.2质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603，分别作为产ESBLs阴性和阳性对照菌。

    1.1.3 VITEK-AMS细菌鉴定系统及配套的GNI鉴定卡与GNS-120药敏卡为生物梅里埃公司生产。

    1.1.4 药敏纸片 头孢替坦（CTT）、头孢吡肟（FEP）为英国Oxoid产品，亚胺培南（IPM）由默沙东公司提供，头孢哌酮/舒巴坦（SCF）为舒普深公司提供，哌啦西林/他唑巴坦（TZP）等纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司。

    1.1.5药敏用培养基 Mueller-Hinton琼脂，英国Oxoid产品。

    1.2方法

    1.2.1菌株培养和鉴定细菌分离培养按照《全国临床检验操作规程》进行。用VITEK-AMS专用卡GNI+鉴定。

    1.2.2ESBLs检测

     （1）VITEK-AMS测定:采用GNS-120专用药敏卡，严格按说明书操作，仪器自动检查其ESBLs4个检测孔，头孢他啶（CAZ）与头孢他啶/克拉维酸（CAZ/CA），头孢噻肟（CTX）与头孢噻肟/克拉维酸（CAZ/CA）孔的生长浊度≥50%时，判定为ESBLs阳性。

    （2）双纸片协同试验及确认试验:将阿莫西林/克拉维酸（AMC）纸片置Mueller-Hinton平板中央，依次贴上头孢曲松（CRO）、CAZ、CAZ/CA、ATM、CTX、CTX/CA，其中CRO、CAZ、氨曲南（ATM）、CTX与AMC距离为18mm，CAZ/CA、CTX/CA与AMC距离为25mm，且CAZ/CA、CTX/CA与其它纸片间距离>24mm。

    （3）双纸片协同试验结果判断:如在AMC纸片与其周围CRO、CAZ、ATM、CTX任一种纸片处出现协同抑菌视为产超广谱β-内酰胺初筛阳性。

    （4）确认试验:按NCCLs纸片标准，CAZ、CAZ/CA和CTX、CTX/CA2组抗生素纸片任一组中含CA的纸片和不含CA的纸片菌抑菌圈直径相差≥5mm，即为产ESBLs菌株。

    1.2.3产ESBLs+AmpC酶株的检测

    （1）表型筛选试验参阅文献 ［1，2］选用IPM、FEP、CAZ/CA、CAZ、CTX/CA、CTX、CTT7种抗生素进行筛选试验。若IPM敏感，而CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA耐药为产ESBLs+AmpC酶株。

    （2）扩散协同试验参阅文献 ［3，4］经表型筛选试验为产ESBLs+AmpC酶株作扩散协同试验，每株菌取两平板，一平板将AMC纸片置Mueller-Hinton平板中央，四周依次贴上CAZ、CTX、ATM、CRO;另一平板将AMC纸片置Mueller-Hinton平板中央，在与AMC纸片距离为15mm、20mm、25mm、30mm处各贴FEP。若AMC与CAZ、CTX、ATM、CRO不协同，但与

FEP协同为产ESBLs+AmpC酶株。

    1.2.4药敏试验采用纸片扩散（K-B法），判断标准按NCCLs2002版标准执行。

    1.2.5统计分处理采用WHONET5软件。

    2结果

    2.1产ESBLs阳性率及病房分布临床分离株138株，经VITEK GNS-120卡鉴定56株产ESBLs，纸片协同法55株产ESBLs，纸片确认法57株产ESBLs占41.3%（57/138）。各科室产ESBLs株从高到低依次为:神经外科30株，其中28株为NCU病房，2株为普通病房的同一床位，且时间较近。ICU病房8株，婴儿科5株，其余8株来自外科病房，6株来自内科病房。

2.2 产ESBLs+AmpC酶阳性率

　　57株产ESBLs的肺炎克雷伯菌中，2株表型CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA均耐药，IPM敏感，确定为ESBLs+AmpC酶株，占1.4%（2/138），另外55株产ESBLs肺炎克雷伯菌，有23株CTT纸片抑菌环内存在散在菌落，挑取其散的菌落，经VITEK鉴定为肺炎克雷伯菌，对其进行表型筛选试验，CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA耐药，IPM敏感。说明其散在菌落为同时产ESBLs+AmpC酶株，占16.7%（23/138），25株占18.1%（25/138）。对25株表型为产ESBLs+AmpC酶株进行扩散协同试验:FEP与AMC距离为15mm时，23株发生协同反应;距离为20mm时，17株发生协同反应;距离为25mm时，10株发生协同反应;距离为30mm时，2株发生协同反应。

    2.3耐药率

    2.3.1非ESBLs、ESBLs+AmpC酶株、产ESBLs、产ESBLs+AmpC酶的肺炎克雷伯菌的耐药性，见表1。 表1非产ESBLs、ESBLs+Ampc酶株，产ESBLs株，产ESBLs+Ampc酶株对16种抗菌药物的药敏结果（略）注:与Ⅰ组比较， * P<0.05;与Ⅱ组比较， △ P<0.05

    2.3.223株CTT纸片抑菌环内散在菌落（产ES-BLs+AmpC酶株）与原分离株（产ESBLs）药敏对照:对IPM均敏感，产ESBLs株对环丙沙星（CIP），庆大霉素（GM）、阿米卡星（AK）、复方磺胺甲口恶唑（SXT）敏感的，对应的产ESBLs、ESBLs+Ampc酶株表现为耐药。

    3讨论

    超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是一类新的β-内酰胺酶（BLA），属Bush分类中的2be类酶，主要产生于大肠埃希菌和克雷伯菌属，能水解三代头孢如头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和单环酰胺类氨曲南，并被BLA抑制剂如克拉维酸抑制 ［5，6］。AmpC酶是染色体或质粒介导的头孢菌素酶，能水解三代头孢及 单环酰胺类，不能被BLA抑制剂和头霉素类抑制，能被四代头孢、碳青霉烯类抑制。产ESBLs+AmpC酶株对三代头孢、单环酰胺类、头霉素类及含酶抑制剂、四代头孢均高度耐药，可用碳青霉烯类及在药敏试验敏感的氨基糖苷类或氟喹诺酮类。本研究发现57株产ESBLs菌中有23株CTT抑菌环内存在散在菌落，而用VITEK-120药敏卡仪器鉴定为CTT敏感。对这类菌株如果用头霉素类或酶抑制剂，则可能筛选出高产的ESBLs+AmpC酶株而导致临床治疗无效，建议临床微生物室对经VITEK GNS-120药敏卡鉴定为产ESBLs株补贴头霉素类药敏，可及时发现抑菌环内的耐药株（产EBSLs+AmpC酶株），并及时将信息报告给临床医生，以有效控制ESBLs+Am-pC酶株的传播流行。

对于产EBSLs+AmpC酶株检测，表现筛选实验符合率为89.58% ［1］ 扩散协同法FEP与AMC距离国内未见报道，本研究参照检测ESBLs扩散协同法 ［7］ ，FEP与AMC距离设定为1mm、20mm、25mm、30mm，产生协同反应分别为23株、17株、10株与2株，故推荐距离15mm时为最佳距离。

作者：卜黎红　徐瑞龙　单小云　许健波　朱以军《全科医学临床与教育》

　　参考文献

    1周志慧，李兰娟，俞云松等.两种检测阴沟肠杆菌AmpC酶方法的比较［J］.中华检验医学杂志，2002，259（2）:88-90.

    2赵虎，孙宪涛.AmpCβ内酰胺的检测［J］.中华检验医学杂志，2003，26（6）:390-392.

    3张乐海，傅云霜，马丽霞，等.双抑制剂扩散协同法检测两种超广谱β-内酰胺酶［J］.中华检验医学杂志，2001，24（4）: 211-213.

    4Tzouvelekis LS，Vatopoulos AC，katsanis G，et al.Rare case of failure by an automated system to detect extended-spectrum beta-lactamases in a cephalosporin-resistant klebsiella pneumoniae isolate［J］.J Clin Microbiol，1999，37（7）:2388.    

　5Jacoby GA.Extend-spectrumβ-lactamases and other en zymes providing resistance to oxyimino-β-lactams［J］.Infect Dis Clin North Am，1997，11（4）:875-887.

   6俞云松，陈亚岗，周伟珠，等.一种新基因型SHV-28-β-内酰胺酶的发现及其特性的初步研究［J］.中华检验医学杂志，2001，24（4）:204-206.

   7赵旺胜，许乃顺，葛高霞，等.南京地区产超广谱β-内酰胺酶株的调查及药敏分析［J］.临床检验杂志，2000，18（4）:233-234.