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5株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的耐药机制分析

录入时间:2011-1-28 9:41:00 来源：中国论文下载中心

【摘要】 目的了解5株分离于临床的第一类整合子阳性铜绿假单胞菌分子生物学特点。方法应用PCR的方法确定5株铜绿假单胞菌含有第一类整合子并且对其整合耐药基因盒进行扩增和测序，通过PFGE分析该5株菌的同源性。结果 5株铜绿假单胞菌均为第一类整合子阳性菌株并且都携带2360bp的耐药基因盒，包括aacA4和含有终止突变的cmlA1。PFGE结果显示5株铜绿假单胞菌来自同一克隆。结论整合子在临床致病菌的多重耐药性中起着重要作用，本研究提示应加强细菌耐药性的监测以及防止相关病菌在院内的传播。

【关键词】 整合子；铜绿假单胞菌； PFGE

目前，对细菌耐药机制的研究已成为研究的热点。携带耐药基因是细菌显示耐药性的重要原因之一。耐药基因主要可以通过质粒、转座子和整合子等进行水平传播，其中整合子水平式传播是介导革兰阴性菌特别是肠道菌和假单胞菌属细菌多重耐药的重要原因。现已确认至少有9种整合子，但是起最主要作用的为第一类整合子［1，2］。第一类整合子主要由两个保守端以及在保守端之间的耐药基因盒组成。5′保守端有编码整合酶的intI1基因及启动子，大多数3′保守端有三个ORF：编码耐季铵盐化合物及溴乙锭的耐药基因(qacE△1)、耐磺胺耐药基因(sulI)和功能不明的ORFu。整合子在整合酶的催化下，通过整合酶在59bp的特定识别位点，将游离的耐药基因盒整合到自身。耐药基因盒中的耐药基因不能自身表达，当它整合到整合子后，在整合子5′保守区域的启动子的作用下得到表达，使细菌显示出耐药性。一些数据表明细菌整合子可以携带多个耐药基因盒，同时对多种抗生素产生抗性。因此研究整合子介导的细菌耐药机制，对研究细菌的多重耐药有非常重要的意义。

本文对5株临床分离的第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的耐药基因盒进行检测，分析其耐药基因，并对其相关的同源性进行比较。进一步讨论条件致病菌在院内的传播以及整合子在细菌耐药中的介导作用。

1 材料和方法

1.1 实验用菌株

实验所用的5株铜绿假单胞菌均分离自2006年暨南大学附属第一医院患者样本。第一类整合子阳性对照菌株为V.cholerae O1 SK 10，由丹麦皇家畜牧兽医和农业大学兽医微生物学研究室Anita Forslund博士惠赠；第一类整合子阴性对照菌株为E.coli C600由日本大阪府立大学国际防疫学研究室山崎伸二教授惠赠。

1.2 细菌培养鉴定及药敏试验

法国BioMerieux公司全自动微生物分析仪(Vitek32型)鉴定，药敏试验采用纸片扩散法，药敏纸片及MH培养基由英国Oxiod公司生产，根据推荐方案选用药敏纸片。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、金葡菌ATCC25923和铜绿假单胞菌ATCC27853。抗生素纸片有阿米卡星(AMK)、氨曲南(AZ)、头孢他啶(CAZ)、头孢哌酮(CPZ)、氯霉素(CHL)、环丙沙星(CPLX)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、头孢吡肟(CPE)、庆大霉素(GM)、亚胺培南(IPM)、哌拉西林(PIPC)、复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)和妥布霉素(TOB)共14种。药敏方法和结果判断参照CLSI(2006)标准。

1.3 DNA模板的制备和引物的设计

菌株DNA提取参照文献［3］，用SDS溶液裂解细胞，用蛋白酶K水解蛋白质，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提蛋白，冷冻无水乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液(pH8.0)溶解。取1μl作为DNA模板进行PCR反应。引物分别用来扩增整合酶基因intI，耐药基因盒的引物见表1。

1.4 PCR反应

50μl反应总体积的组成：10×PCR缓冲液5μl，引物各3μl，dNTP 4μl，DNA模板1μl，无菌去离子水33.75μl，0.25μl Taq DNA聚合酶(5U/μl，TaKaRa生物工程公司)。PCR反应仪为ABI 2700。intI1扩增循环条件：裂解温度94℃ 5min，每个循环为94℃ 0.5min，52℃ 0.5min，72℃ 1min，30个循环。最后72℃延伸7min。耐药基因盒扩增循环条件为：94℃ 5min，94℃ 0.5min，52℃ 0.5min，72℃ 2min，30个循环，最后72℃延伸7min。

1.5 PCR产物的检测

取PCR产物5μl在1%的琼脂糖凝胶上100V电泳25min，EB溶液染色10min，水洗10min，BIORAD凝胶成像系统照相检测。

1.6 耐药基因盒扩增产物的纯化、测序及序列分析

用耐药基因盒特异性引物inF和inB扩增得到的产物使用separations spin colums(Princeton separation公司)和MBI Fermentas Gel Extraction Kit(MBI Fermentas公司)按照指导说明进行纯化，连接到pGMT载体(Promega)，转化至DH5α以供测序及后续研究使用。使用Genetyxversion 7.0(Software Development公司)软件以及在www.ncbi.nlm.nih.gov网站对序列进行分析，应用标准核苷酸BLAST对获得的基因片段进行同源性检索。

1.7 脉冲场凝胶电泳(PFGE)

试剂和方法按文献［4］进行。细菌在L培养基中培养到A600为0.8～1.0，将菌体溶解在低熔点凝胶(BioRad公司)中，用溶菌酶溶解液将菌体溶解，用50U的XbaI酶(TaKaRa)过夜消化凝胶栓中的基因组DNA，然后按厂家说明将凝胶栓放入嵌位均匀电场电泳仪(CHEF Mapper，Bio2Rad公司)于14℃电泳40h，而后在EB溶液中染色10min，水洗10min，在BIORAD

表1 本实验用以扩增第一类整合酶和耐药基因盒的引物

引物类型引物系列靶位注册号参考文献 INT1U5′ACGAGCGCAAGGTTTCGGT3′Y18050本文 INT1D5′GAAAGGTCTGGTCATACATG3′intI1Y18050本文 inF5′GGCATACAAGCAGCAAGC3′耐药基因U123385 inB5′AAGCAGACTTGACCTGAT3′U123385

凝胶成像系统照相检测。

2 结果

2.1 菌株的药敏检验结果

药敏实验结果表明5株铜绿假单胞菌均为多重耐药菌，且对头孢他啶、头孢哌酮、环丙沙星、头孢曲松、头孢噻肟、庆大霉素、哌拉西林、复方磺胺甲口恶唑和妥布霉素都显示出耐药性，结果见表2。

2.2 第一类整合子检测结果

5株铜绿假单胞菌在用INT1U和INT1D(表1)这对引物扩增第一类整合酶基因(intI)时，均得到了565bp的扩增产物，与理论相符合，确定为第一类整合子阳性菌株。

2.3 耐药基因盒序列分析

对5株第一类整合子阳性菌株用inF和inB特表2 5株铜绿假单胞菌药敏结果异性引物扩增其整合的耐药基因，结果从5株菌株均可以得到2360bp的PCR产物(图1)。选取该5株菌中P10所扩增的2360bp片段进行测序，序列分析表明该片段含aacA4耐药基因盒和cmlA1耐药基因盒，其中aacA4编码对氨基糖苷类抗生素如卡那霉素、妥布霉素的耐药性，而其携带的cmlA1基因盒中的cmlA1基因在267位的核苷酸有终止突变：GenBank中公布的cmlA1序列(序列号AJ639924)在267位的核苷酸为胸腺嘧啶(C)，而P10的cmlA1序列在267位为鸟嘌呤(G)，使原先的酪氨酸密码子突变为终止密码子，导致转录终止。对其余4株菌的该部分基因盒再次测序均得到与P10相同结果，即cmlA1基因盒中的cmlA1基因均有同样的终止突变。所以该突变cmlA1不能编码相关蛋白质。

2.4 PFGE结果

PFGE结果显示5株铜绿假单胞菌P5、P6、P10、P14和P26的条带完全一致，PFGE结果相同，说明5株PA来自同一克隆。

2.5 GenBank注册号码

所测序的2360bp片断在GenBank的注册号码为AB214531。

M: DL2000 marker； 1：P5； 2：P6； 3：P10； 4： P14； 5：P26

图1 引物inF and inB PCR反应产物电泳图

3 讨论

目前，整合子系统对于研究细菌的耐药性显得尤为重要［6］。来自临床的耐药菌株中，整合子的阳性率在50%以上［2，7，8］。同时，在畜牧业和环境等各方面分离出来的菌株也有整合子介导的耐药菌株存在。在院内感染分离出来的菌株中，由于患者抵抗能力差，致病菌在患者体内存活时间长，因此在多种抗生素的选择压力下容易形成多重耐药菌株。为此，研究院内感染细菌的耐药性十分重要，对于治疗和新型抗生素的研发有一定指导作用。

铜绿假单胞菌是院内获得性感染的常见致病菌，耐药率高、耐药机制复杂，并且有逐年增多的趋势。在该5株第一类整合子阳性的铜绿假单胞株中均携带aacA4的耐药基因。aacA4是编码对氨基糖苷类抗生素产生抗性的耐药基因，它在第一类和第三类整合子中均有发现［2］。同时，据报道，编码氨基糖苷类的耐药基因盒为最常见的一类耐药基因盒，目前至少有14种耐氨基糖苷类的基因盒已经被发现［9］。但是，aacA4编码的蛋白并非对所有种类的氨基糖苷类药物均耐药，因为aacA4编码的是氨基糖苷6′N乙酰转移酶［AAC(6′)I或II］，所以并不产生对大观霉素和链霉素这类氨基糖苷类抗生素的耐药性。通过BLAST分析，在该整合子携带的aacA4基因属于aac(6′)Ib，它编码的蛋白是AAC(6′)的第一亚类，即AAC(6′)I。据相关报道，aac(6′)Ib可以产生对妥布霉素、卡那霉素和阿米卡星的抗性，对庆大霉素的抗性不明显［10］。但是从药敏实验的结果来看，5株铜绿假单胞菌均对妥布霉素和庆大霉素耐药，阿米卡星对P10、P14与P26为中介，P5和P6则为敏感。出现这种结果的原因可能有很多，首先，整合子内耐药基因的表达机制还未能完全阐明清楚。其次，细菌对氨基糖苷类抗生素产生抗性的原因有很多，除了酶修饰的作用外，还有细菌产生的不渗透性。其中有修饰作用的酶除了氨基糖苷乙酰转移酶外，还有氨基糖苷磷酰转移酶、氨基糖苷核苷酸转移酶。因此，对于细菌的耐药情况，特别是多重耐药菌，仅仅从一个方面考虑是不够的。另外，目前在临床上应用的较多的氨基糖苷类药物则为妥布霉素、阿米卡星等，所以随着抗生素应用的变化，耐药基因盒的种类和数量也会有相应的变化。

另外，5株铜绿假单胞菌的第一类整合子在携带aacA4耐药基因盒的同时，均携带含有终止突变的cmlA1耐药基因盒，因为该终止突变点在离基因起始位点的第267个核苷酸处，所以不能转录翻译出完整的蛋白质。从药敏实验的结果来看，5株阳性的铜绿假单胞菌均对氯霉素敏感，从表型上证实cmlA1基因由于终止突变的失效。cmlA1本身是一种编码对氯霉素的耐药的基因，它的产物与铜绿假单胞菌的排出泵有关。低浓度的氯霉素就可以诱导cmlA1的表达；CmA1蛋白主要位于内膜，它可以与某些细菌内源的泵出机制共同作用。在细菌的耐药机制中，泵出机制也是十分重要的一个方面。当与细菌排除泵相关的基因被整合子整合以后，更加有利于细菌耐药的传播。同时也说明细菌的耐药机制并非单独作用而是相互联系的。

由于多重耐药的菌株在人体内的积累，这种细菌耐药性的传播为治疗带来较大困难，同时也为传染病的暴发及流行提供了可能性。从PFGE的结果可以明显看出，5株铜绿假单胞菌为同一个克隆株，由于该5株菌分离自暨南大学附属第一医院同一段时间内不同患者的样本，说明加强控制院内感染致病菌的重要性。因为导致院内感染的多为条件致病菌，而患者往往抵抗力低，所以应该注意合理布局病房，加强相关医疗器械和设备特别是呼吸机的消毒，加强医护人员的无菌操作等以减低或防止致病菌在院内的传播。本实验通过对分离自临床的5株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌相关特性进行分析，说明了整合子系统在细菌耐药机制中的重要性，同时提示我们需要加强细菌耐药性的监测以及防止相关病菌在院内的传播。

作者：肖增璜刘菊珍付强石磊《中国抗生素杂志》

【参考文献】

［1］ Plante I, Centron D, Roy P H. An integron cassette encoding erythromycin esterase, ere(A), from Providencia stuartii ［J］. J Antimicrob Chemother,2003,51(14):787～790.

［2］ Lee M D, Sanchez S, Zimmer M, et al. Class 1 integronassociated tobramycingentamicin resistance in Campylobacter jejuni isolated from the broiler chicken house enviornment ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2002,46(11):3660～3664.

［3］ Sambrook J, Frishch E F, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual ［M］. 2ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,439～450.

［4］ Baele M, Baele P, Vaneechoutte M, et al. Application of tRNA intergenic spacer PCR for identification of Enterococcus species ［J］. J Clin Microbio,2000,38(11):4201～4207.

［5］ Mazel D, Davies J. Antibiotic resistance in microbes ［J］. Cell Mol Life Sci,1999,56(9～10):742～754.

［6］张宏梅，石磊，李琳. 细菌耐药机制的研究热点－整合子系统［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2003，23(10)：831～832.

［7］李心晖，石磊，杨维青，等. 三类整合酶基因(intI)的简并引物PCR方法建立及应用［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(2)：156～160.

［8］ Pater J, Toleman M A, Deshpande L M, et al. Pseudomonas aeruginosa strains harbouring an unusual blaVIM4 gene cassette isolated from hospitalized children in Poland (1998～2001) ［J］. J Antimicrob Chemother,2004,53(3):451～456.

［9］ Mazel D, Dychino B, Webb V A, et al. Antibiotic resistance in the ECOR collection: Integrons and identification of a novel aad gene ［K］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(6):1568～1574.

［10］ Poole K. Aminoglycoside resistance in Pseudomonas aeruginosa ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2):479～487.

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