国内9家医院铜绿假单胞菌消毒剂-磺胺耐药基因的研究

【摘要】  目的 调查临床分离铜绿假单胞菌消毒剂-磺胺耐药基因qacE△1-sulI的存在情况。方法 收集国内9家医院临床分离的311株铜绿假单胞菌，采用PCR法检测qacE△1-sulI基因。结果 311株铜绿假单胞菌196株检出qacE△1-sulI基因，总检出率为63.0%。9家医院铜绿假单胞菌qacE△1-sulI基因检出率有较大差异。结论 9家医院临床分离铜绿假单胞消毒剂-磺胺耐药基因qacE△1-sulI携带率高。

【关键词】  消毒剂； 磺胺； 耐药基因； 铜绿假单胞菌

    ABSTRACT  Objective  To investigate the distribution of the antiseptic-sulfadiazine-resistance gene qacE△1-sulI in Pseudomonas aeruginosa isolated from nine hospitals in China.  Methods  qacE△1-sulI gene were detected by PCR methods in 311 clinical strains of Pseudomonas aeruginosa collected from the hospitals. Results  196 of 311 isolates were positive for qacE△1-sulI gene (63.0%) and the positive rates were diverse in the hospitals.  Conclusion  The study showed that the positive rate of qacE△1-sulI gene was high and diverse in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa in China.

    KEY WORDS  Antiseptic;  Sulfadiazine;  Resistance gene;  Pseudomonas aeruginosa

     铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是医院感染(如肺炎、败血症、尿路感染、伤口感染等)的最重要的病原菌之一，容易引起医院感染的暴发和流行。与耐抗菌药物菌株一样，耐消毒剂菌株的出现可能将导致医院消毒的失败。细菌耐消毒剂主要为获得qac基因所致。在细菌耐药机制中I类整合子起着非常重要的作用，它的3′保守端有消毒剂的耐药基因(qacE△1)和磺胺耐药基因(sulI)。为了解国内9家医院PA消毒剂-磺胺耐药基因qacE△1-sulI的流行现状，我们对2003年1月～2004年12月从临床标本中分离到的311株PA进行qacE△1-sulI基因检测和分析，现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  菌株来源、鉴定

    收集国内部分地区9家医院临床分离的PA菌311株，包括江苏省南京医科大学附属无锡第一医院26株(医院A)、江南大学附属医院无锡市第五人民医院37株(医院B)、浙江省湖州解放军第98医院30株(医院C)、浙江省绍兴市第二人民医院39株(医院D)、丽水市人民医院40株(医院E)、苏州大学附属第二医院33株(医院F)、北京解放军第304医院35株(医院G)、天津市第四医院36株(医院H)、湖北省同济医学院附属襄樊医院35株(医院I)。标准菌株铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心。qacE△1基因扩增阳性对照来自PA，由无锡市克隆遗传技术研究所筛查获得，并经测序证实。

    1.2  细菌qacE△1-sulI基因的检测

    (1)PCR模板提取  挑单个菌落少许置入内含50μl裂解液(0.5%非离子去污剂NP40配制的400μg/ml蛋白酶K)中，置55℃水浴消化1h，改置95℃水浴灭活10min，15000r/min 30s，上清液即为qacE△1-sulI基因PCR模板液。

    (2)PCR引物序列与合成  根据GenBank中已发布的I类整合子基因序列设计引物，I类整合子qacE△1与sulI基因为重叠基因，本研究在qacE△1下游设计引物P1，在sulI上游设计引物P2，引物序列如下：P1：5′-TAGCGAGGGCTTTACTAAGC-3′，P2：5′-ATTCAGAATGCCGAACACCG-3′，PCR扩增后阳性产物为300bp。PCR扩增阳性表示qacE△1与sulI基因同时存在。

    (3)PCR扩增体系  每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。总反应体积20μl，其中模板液5μl。热循环参数均为：93℃预变性2min，然后93℃ 30s→55℃ 30s→72℃60s，共35周期。最后一个循环72℃延伸至5min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察结果，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，并拍照保存。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供，纯水为阴性对照。

    2  结果

    311株PA中196株检出qacE△1-sulI基因，阳性率为63.0%。qacE△1-sulI基因PCR电泳图见图1。9家医院PA菌耐消毒剂基因qacE△1-sulI存在状况见表1，各医院qacE△1-sulI基因检出率有较大差异，有的医院检出率高达100%。本研究对部分qacE△1-sulI基因PCR阳性产物进行了测序，测得序列一致，与已在美国核酸数据库(GenBank)中已登录的qacE△1-sulI基因序列(登录号U12338)完全相同。

    3  讨论

    消毒灭菌是控制医院感染的重要方法，随着消毒    M：分子量标记，由上而下分别为50、100、150、200、250、剂广泛使用，尤其是消毒剂被广泛引入日常生活和畜、禽、水产等养殖业，消毒剂的过度使用促使细菌产生耐消毒剂现象。细菌对消毒剂的耐药现象是人类医学中的一个新问题，尤其在医院感染的传播中，对消毒剂的耐药性可能是重要因素之一。

  早在1951年Lowbury就观察到了PA对季铵盐类消毒剂(如洁尔灭、新洁尔灭、度来芬)有耐受现象，之后陆续发现了对双胍类(如洗必泰)、醛类、酚类、醇类、碘类、含氯消毒剂等的耐受菌株［1］。国内黄忠强等也发现了对消毒剂耐受的PA［2］。细菌耐消毒剂主要为获得qac基因所致。qac基因表达多种消毒剂化合物外排泵(multidrug efflux pump)蛋白，获得qac基因可表现为对胺类、胍类、腙类消毒剂耐药［3］。目前已发现的qac基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacE△1、qacF、qacG、qacH、qacJ等10种［4，5］，其中葡萄球菌易获得qacA或qacB基因而耐消毒剂，革兰阴性菌易于获得qacE△1基因而耐消毒剂［6］。我国也从MRSA中发现qac基因［7］。sulI为二氢蝶酸合成酶的编码基因，阳性提示细菌对磺胺类药物耐受。国内颜英俊等［8］报道耐亚胺培南PA菌qacE△1-sulI基因阳性率为41.2%，王家平等［9］报道大肠埃希菌qacE△1-sulI基因阳性率为58.5%，徐卫东等［10］报道产ESBLs肺炎克雷伯菌qacE△1-sulI基因阳性率为37.1%，黄支密等［11］调查了117株临床分离的革兰阴性杆菌qacE△1-sulI存在状况，结果96株阳性，总阳性率为65.3%，其中阴沟肠杆菌、PA菌、鲍氏不动杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌和黄杆菌属细菌qacE△1-sulI基因阳性率分别为85.0%、83.3%、82.5%、10.5%和0，表明耐消毒剂基因广泛存在于革兰阴性菌中。本研究结果显示，国内PA菌qacE△1-sulI基因的携带率已达63.0%，且9家医院qacE△1-sulI基因检出率有较大差异。PA菌耐消毒剂qacE△1基因极高的携带率应引起国内医院感染控制部门的广泛重视，而且qacE△1-sulI基因由整合子介导，可被革兰阳性和革兰阴性菌广为获取［12，13］。

    近年来大量文献报道，覆有氯已定(双胍类消毒剂)和磺胺的II代导管能有效预防细菌定植和细菌生物膜形成［14～16］，氯己定浸敷料可降低硬膜外、血管内插管或出口处的细菌定殖危险［17］，但在细菌qacE△1-sulI基因高检出率的医疗单位其作用需另作评价。正如抗菌药物滥用导致高耐药率一样，细菌耐消毒剂现象也正向我们迫来。由于国内外尚无细菌消毒剂耐药药敏试验的标准出台，消毒剂耐药基因检测技术为细菌耐消毒剂的临床研究、分子流行病学研究提供了快捷手段。

致谢：浙江省湖州解放军第98医院黄支密、浙江省绍兴市第二人民医院钱小毛、丽水市人民医院王伟、苏州大学附属第二医院朱雪明、北京解放军第304医院常东、天津市第四医院付建荣、湖北省同济医学院附属襄樊医院李智山提供实验菌株。

 

作者：王春新 王继东 蔡培泉 过毅 糜祖煌《中国抗生素杂志》

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