铜绿假单胞菌是临床最常见的条件致病菌之一,已对临床感染的控制构成严重威胁［１～３］。现就本院ICU近三年来分离的铜绿假单胞菌耐药性进行研究分析。
1 资料与方法
1.1 菌株
收集2002年6月至2005年6月ICU住院患者分离的铜绿假单胞菌67株，细菌来源包括痰液58株，咽拭子7株，留置导尿2株。
1.2 主要试剂
2-巯基丙酸（2-MPA）购自Sigma公司。抗菌药纸片：氨苄西林/舒巴坦，替卡西林，替卡西林/克拉维酸，哌拉西林，哌拉西林/他唑巴坦，头孢哌酮，头孢哌酮/舒巴坦，头孢吡肟，头孢他啶，阿米卡星，环丙沙星和复方新诺明，均为英国 Oxoid公司产品。
1.3 方法
采用Kirby-Bauer琼脂扩散法，结果按NCCL 2005年版判断［４］。质控菌株为铜绿假单细胞ATCC 27853。
1.4 金属β内酰胺酶（金属酶）测定
采用2-巯基丙酸（2-MPA）协同试验方法［５］，在预告已涂布待检菌MH平板上分别贴上2-MPA纸片和头孢他啶纸片，两纸片中心间距30mm，过夜培养后观察结果，凡头孢他啶片抑菌环扩大者即判为产金属酶阳性。
1.5 金属酶和外膜蛋白分析
用PCR方法分别检测金属酶IMP型和VIM型和外膜蛋白D2（oprD2）。靶基因引物序列（5'→3'）IMP型为CTACCGCAGCAGAGTCTTTC和AACCGTTTTGCCTTACCAT；VIM型为ATTCCGGTCGG（A/G）GAGGTCCG和GAGCAAGTCTAGACCGCCCG；oprD2为GCGCATCTCCAAGACCATG和GCCACGCCATTTGACGGAG。碱裂解法提取DNA模析，按说明书设置各PCR反应体系和热循环参数，PCR扩增仪为PE 9600型。扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，PCR检测阳性对照DNA(以上试剂盒及对照物均由无锡克隆遗传所提供)。
2 结果
2.1 金属酶检出结果
检出产金属酶菌28株（41.8%），分别为痰液25株，咽拭子3株。基因检测23例阳性，其中IMP型17株，VIM型6株，型别不明5株。 检测有32株缺失。
2.2 药敏试验结果
见表1。表1 67株铜绿假单胞菌对13种抗生素耐药率（略）
3 讨论
铜绿假单胞菌的耐药机制主要有外膜蛋白D2丢失和产生β内酰胺酶，其中产生金属酶可导致几乎对所有的β内酰胺类抗生素耐药，且酶抑制剂的抑制作用很弱［６］。本研究结果，在67株细胞中用2-MPA协同试验有28株为产金属酶株；基因检测有23株阳性，目前已知的金属酶基因型有IMP、VIM、L1、OXA、GES、2TFFU等［７］，是否还有其它基因型别尚有待研究。值得关注的是2003年和2004年的菌株基因型以IMP为主，随后演变为以VIM为主，总共有32株细菌证明蛋白D2 缺失，其中产金属酶的菌株均为缺失，表明外膜通道不畅也是导致细菌耐药的主要原因之一。
近年来，铜绿假单胞菌对β内酰胺类抗菌药物的耐药率已有上升趋势，尤其是产金属酶的菌株。对13种常用药物的检测结果表明，产金属酶菌株除对替卡西林、亚胺培南全部耐药外，对氨苄西林/舒巴坦、复方新诺明、哌拉西林、头孢他啶、头孢哌酮、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星的耐药率也在50%～93%之间。耐药率＜50%的仅有阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦和头孢吡肟，与文献相近［１，２，８］。按照对亚胺培南、头孢他啶、哌拉西林、环丙沙星等均耐药的铜绿假单胞菌定义为多药耐药铜绿假单胞菌（MDRP）［９］，28株产金属酶菌株大多还对复方新诺明和环丙沙星耐药，属于MDRP。对于产金属酶细菌的治疗，目前尚无应用于临床的金属酶抑制剂，氨曲南不被金属酶所水解，但临床应用的效果并不理想，头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦显示有较好的敏感性，必要时，可与氨基糖苷类或氟诺酮类联合使用。
作者：陈燕青 赵仲农 钱小毛《浙江临床医学》
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