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烟曲霉不同菌株致病力差异的研究

录入时间:2010-12-29 9:49:54 来源：中国论文下载中心

【摘要】 目的通过筛选出致病力最强和最弱的菌株研究烟曲霉的致病机制。方法 SPF级雄性ICR小鼠216只，体重(20±0.5)g。随机分9组，每组8只（感染组7组，阴性对照组和正常对照组各1组）。其中感染组和阴性对照组小鼠免疫抑制后，分别接种7株烟曲霉的孢子悬液和生理盐水。正常对照组不注射环磷酰胺和孢子悬液。每日观察小鼠的生存状态。对死亡小鼠和处死小鼠的脏器进行组织匀浆菌落计数和病理学检测。实验重复3次。通过比较生存率、中位生存期、平均体重、组织匀浆菌落计数和组织病理学变化等来比较烟曲霉的致病力差异。结果 ①感染组小鼠接种孢子悬液后，体重迅速下降。肺组织病理学检测观察到组织坏死，菌丝聚集；肺组织匀浆培养得到的菌株经分子生物学鉴定为烟曲霉。②阴性对照组小鼠体重下降速度较感染组慢，无死亡；肺组织病理学检测未见菌丝侵袭。③通过比较生存率、中位生存期、组织病理学变化等指标，从7株烟曲霉中筛选得到致病力最强和最弱的菌株（烟曲霉JLC 50134和JLC 30566）。结论不同烟曲霉菌株间存在致病力的差异。

【关键词】 致病力；动物模型；烟曲霉

　　烟曲霉（Aspergillus fumigatus）感染所致侵袭性肺曲霉病（IPA）是引起高危患者（如中性粒细胞减少症、造血干细胞移植、长期高剂量使用激素和血液恶性肿瘤等免疫力低下患者）致死性感染的主要原因。由于IPA的发病率高、病情进展迅速、死亡率高（60%～90%）及缺乏有效的治疗药物〔1～2〕，其相关研究受到了极大关注。目前，烟曲霉的致病机制尚不明确，已往的研究多集中在通过改造单一或几个与致病性相关的基因来研究菌株的致病机制〔3〕，而通过比较不同烟曲霉菌株间致病力差异进行研究在国内尚未见报道。获得致病力不同的菌株，可以全面、系统地分析和比较与致病力相关的诸多因素，对烟曲霉的致病机制以及治疗药物开发等方面的研究非常必要。本研究将通过评价生存率、中位生存期、组织病理学变化等指标，比较7株不同烟曲霉致病力的差异。
　
　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　SPF级ICR小鼠216只，雄性，6周龄，体重(20±0.5)g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK吉20072003。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》〔4〕。烟曲霉共7株，其中，强毒株JLC 50134由日本国立千叶大学真菌医学研究中心馈赠，编号IFM 40808。JLC 30542、JLC 30890、JLC 30859、JLC 30566、JLC 31106及JLC 31753分离自临床患者和环境样本，经分子生物学鉴定后，由吉林大学真菌研究中心菌种保藏中心(Culture Collection of Jilin University Mycology Research Center)分离并保藏。

　　实验用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）购自Difco公司，注射用环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 孢子悬液的制备

　　将烟曲霉接种于PDA斜面培养基上，28℃培养5 d。用含有0.05%吐温 80的生理盐水制备一定浓度的孢子悬液。将孢子悬液进行连续稀释后涂布在PDA平板培养基上，28℃培养3 d，进行菌落计数，与涂布的孢子悬液浓度进行比较，计算孢子活力〔（菌落计数×稀释倍数）/孢子悬液浓度〕＞90%可进行接种〔5〕。

　　1.2.2 接种浓度的确定

　　配制烟曲霉JLC 50134的孢子悬液（浓度：1.0×103～1.0×109 CFU/ml共7个梯度）感染小鼠，每个浓度10只，预计选用3 d内导致50%小鼠死亡的孢子悬液浓度作为实验接种浓度〔5〕。

　　1.2.3 动物的免疫抑制和分组

　　随机挑选小鼠216只，分9组（感染组7组，阴性对照组和正常对照组各1组），每组8只。饲养于IVC鼠笼中，室温（24℃～26℃），保持湿度，日照14 h和黑夜10 h交替进行，垫料、食物和水灭菌处理。饮水中加入四环素（1 mg/ml）防止细菌感染，实验过程中不限食水。感染组和阴性对照组第1、4天腹腔注射环磷酰胺（150 mg/kg）进行免疫抑制〔5〕，第5天尾静脉采血计数外周血白细胞数量，通过白细胞减少的程度确定小鼠是否受到免疫抑制。

　　1.2.4 实验动物的接种

　　小鼠通过吸入乙醚麻醉，使其昏迷超过1 min，抑制吞咽反射。取30 μl不同浓度或不同菌株的烟曲霉孢子悬液（孢子活力＞90%）滴入一侧鼻孔；阴性对照组小鼠进行同样麻醉，接种等量的含有0.05%吐温80的生理盐水；正常对照组小鼠不注射孢子悬液和生理盐水。

　　1.2.5 动物感染过程监测、脏器处理及感染菌株鉴定

　　感染后15 d内，每日观察小鼠的生存状态，测量体重，计算生存率；取感染死亡小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏进行组织匀浆，稀释至浓度为1.0×10-3g/ml。取200 μl涂布在PDA平板培养基上，28℃培养3 d，进行菌落计数。将脏器剩余部分用10%（v/v）甲醛固定，浸入石蜡，切片，HE染色。15 d后，将仍然存活的小鼠颈椎脱臼法处死，处死小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和肺脏的操作同前。将组织匀浆培养得到的菌株，利用小琼脂块培养法进行初步鉴定。提取菌株DNA，利用真菌通用引物(E1m4和rE2m4)扩增线粒体细胞色素b基因片段〔6〕，并进行DNA序列测定。将测定结果与GenBank中烟曲霉序列进行比对，以验证该菌株是否为烟曲霉。以上实验重复3次。

　　1.2.6 烟曲霉致病力的比较

　　通过综合分析生存率、中位生存期、平均体重、肺组织匀浆的菌落计数及其组织病理学变化来比较7株烟曲霉的致病力。

　　1.3 统计学处理应用SPSS16.0软件对生存率进行Logrank检验，对Log (CFU/gram)进行方差分析。

　　2 结果

　　2.1 接种浓度的确定

　　接种烟曲霉JLC 50134 共7个浓度的孢子悬液，生存率计算结果见表1。发现浓度为1.0×107 CFU/ml时，在第3天50%的小鼠死亡，确定该浓度为实验接种浓度。表1 烟曲霉不同浓度孢子感染小鼠生存率(略)

2.2 小鼠的生存状态

　　注射环磷酰胺前，小鼠外周血白细胞计数为（7.2±0.23 ）×109 CFU/ml，注射环磷酰胺后第5天，小鼠外周血白细胞计数为（1.5±0.45 ）×109 CFU/ml，证实小鼠处于免疫抑制状态〔7〕。感染组小鼠接种孢子悬液2～3 d后，可见活动减少；7～8 d后表现为消瘦、体重急速下降，甚至死亡。阴性对照组小鼠接种等量生理盐水1～2 d内，活动减少，体重稍有下降，2 d后逐渐恢复正常，无死亡。正常对照组小鼠活动良好，体重上升。

　　2.3 小鼠生存率比较

　　JLC 50134感染小鼠的生存率较低，接种后第2天开始出现小鼠死亡，第3天时迅速下降至50%，第4天时生存率仅为10%，第5天时生存率为0。而JLC 30566感染小鼠在第5天时才出现死亡，第6天时生存率达50%，此后再无下降。JLC 31106感染小鼠第5天生存率为75%，至第7天时下降至37.5%，第10天后生存率降至25%。另4株烟曲霉感染小鼠的生存率变化与JLC 31106感染小鼠相似。JLC 50134感染小鼠的中位生存期为4，JLC 30566感染小鼠的中位生存期为6，其他5组均为5。Logrank检验结果为χ2=14.288，P<0.05。故可认为7组小鼠总体生存率的差别有统计学意义，说明JLC 50134感染小鼠生存率较低，JLC 30566感染小鼠生存率较高。见图1。

　　2.4 小鼠平均体重比较

　　7组小鼠感染后平均体重均开始下降，JLC 50134感染小鼠平均体重下降的幅度和速度最大，第3～4天1 d内小鼠平均体重下降约8.0 g，此后全部小鼠死亡。说明该菌感染造成的病理损害非常严重和迅速。JLC 30566感染小鼠的平均体重下降的幅度和速度最小，在第5～6天时下降约3.6 g，第7天后逐渐停止下降，随后稍有上升。说明该菌感染造成的病理损害相对较轻。其他5组的变化介于上述两者之间，下降幅度最大者1 d内约为4.9 g。阴性对照组仅在接种生理盐水后的5 d内平均体重下降，随后逐渐上升，在第9天后逐渐恢复至接种前水平，并不断上升。见图2。

　　2.5 小鼠的组织匀浆培养和菌落计数

　　将小鼠肝脏、脾脏、肾脏和肺脏的组织匀浆涂布在培养基上，28℃培养2～3 d。除肺脏出现白色绒毛样丝状真菌菌落外，其他脏器均未见有菌生长。3 d后菌落呈深绿色粉末状，背面淡黄褐色。经小琼脂块培养、乳酸酚棉兰染色，显微镜下可见多呈45°角分支的分生孢子梗，烧瓶状的顶囊，单层小梗位于顶囊上半部，小梗上可见链状排列的球形分生孢子。结合菌落特征和显微镜下形态学特点，初步鉴定为烟曲霉。计数7株菌感染小鼠肺组织匀浆的菌落数量，以Log (CFU/gram)表示，结果见表2。培养至第3天，阴性对照组和正常对照组组织匀浆无菌生长。7个感染组的组织匀浆菌落计数Log值在2.995 4±0.034 1之间，组间差异无统计学意义(P>0.05)，说明7组间小鼠肺组织匀浆培养得到的菌量一致。表2 7株烟曲霉感染小鼠肺组织匀浆菌落计数（略）

　　2.6 菌株的分子生物学鉴定

　　利用真菌通用引物扩增得到约420 bp的线粒体细胞色素b基因片段，见图3。经过DNA序列测定以及序列比对，证实肺组织中分离得到的菌株是烟曲霉。

　　2.7 小鼠的肺脏组织病理学观察

　　感染组小鼠肺脏组织切片可见致密、有隔、宽度均一（3 ～ 6 μm）的菌丝，放射状或片状生长。分生孢子梗多呈45°角分支，有时可见菌丝侵入血管，伴有肺组织的充血、出血和炎症细胞浸润。

　　烟曲霉JLC 50134和JLC 30566感染小鼠的组织病理学变化见图4。结果显示，JLC 50134感染小鼠肺组织有出血和充血，大量孢子萌发成菌丝体（箭头所示），聚集在血管周围并侵入组织，造成肺泡壁的破坏、炎症细胞浸润（图4a）。JLC 30566感染小鼠可见肺组织结构较为完整，仅有少量出血和炎症细胞浸润（图4b）。通过比较7株烟曲霉感染小鼠的生存率、平均体重、组织病理学变化等指标，筛选出了致病力最强的菌株JLC 50134和最弱的菌株JLC 30566。

3 讨论

　　烟曲霉是一种腐生菌，在环境中分布广泛，且其分生孢子体积微小，极易被人体吸入。若吸入肺泡中的烟曲霉分生孢子逃过宿主的免疫防御系统，就会萌发产生菌丝，侵入肺组织并血行播散至全身引起感染。由于烟曲霉常侵犯免疫力低下的患者，因此选用环磷酰胺腹腔注射造成免疫抑制状态，以提高小鼠对烟曲霉的敏感性。鉴于烟曲霉造成的IPA多为分生孢子经鼻腔吸入肺内所致〔8〕，因此本研究选择鼻腔接种法进行感染，相比气管内接种更加简便快速，对小鼠的伤害较少，能更真实的模拟感染过程，并可避免感染过程中小鼠的意外死亡；此外，该方法容易定量，便于比较不同菌株间致病力的差异。

　　本研究发现，烟曲霉JLC 50134感染小鼠后，生存率下降最快，造成的病理损害最为严重，而烟曲霉JLC 30566感染小鼠后，生存率下降较慢，病理损害较轻。说明JLC 50134和JLC 30566在致病力上存在显著差异，认为分别是致病力最强和最弱的菌株。目前认为烟曲霉致病机制与很多因素相关，研究表明虽然宿主呼吸道内的纤毛可以有效地清除一些分生孢子，但是真菌分生孢子侵入宿主肺泡内，黏附于肺泡基底膜是感染的第一步〔9〕。同时机体的肺泡巨噬细胞在清除分生孢子并阻断孢子萌发方面也有一定的作用。Paris等〔10〕发现烟曲霉黏附因子缺失突变株仍能在肺内定植。而本研究在比较烟曲霉致病力差异时，发现组织匀浆的菌落计数无显著性差异，说明这几株菌的分生孢子能够黏附并定植于肺组织。这与Paris的研究结果相一致。因此，推断菌株致病性可能与孢子的萌发、分泌水解酶和毒性代谢产物等作用相关。今后致病机制的相关研究将从这些方面深入细致地开展。

作者：张宇宋文刚高嵩刘攀王丽《中国老年学杂志》

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