临床酵母样真菌快速鉴定及药敏实验方法的研究

 ［摘  要］ 目的：建立一种临床酵母样真菌快速鉴定和药敏试验方法。方法：采用珠海丽拓公司生产的真菌分离鉴定检测试剂盒，对临床感染真菌标本和酵母样真菌标准菌株进行鉴定，并与法国梅里埃真菌鉴定系统进行对照。结果：6株酵母样真菌标准菌株鉴定符合率为100％，115株临床标本两种试剂鉴定符合率为92.55％，药敏结果显示临床标本对咪唑类抗真菌药物出现较高的耐药性，值得临床重视。结论：本研究所采用方法操作简便，特异性较好，便于临床酵母样真菌标本的常规鉴定。

    ［关键词］ 酵母样真菌；快速鉴定；药敏试验

    在临床上，由于广泛使用抗生素、免疫抑制药物及开展移植手术等因素，致使真菌感染越来越多。而各种抗真菌药物的滥用，更加剧了真菌感染的复发和增加了治疗的难度。近年来的研究发现造成真菌感染的大部分是酵母样真菌。因此，对临床上建立快速酵母样真菌分离培养、鉴定和药敏试验显得尤为重要［1］。目前，临床真菌分离培养、鉴定和药敏试验大多分开进行，要花较多的时间和人力物力，影响临床诊断。为此，笔者对酵母样真菌的快速分离培养、鉴定和药敏试验同时进行的方法学进行了探讨研究，报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  真菌标准菌株  共6株分别是：白色念珠菌1株（编号为CMIDC.1c），热带念珠菌1株（编号为CMIDC.2a），光滑念珠菌1株（编号为CMIDY.10），克柔念珠菌1株（编号为CMIDY.6c），季尔蒙念珠菌（编号为CMIDC.5b），新生隐球菌（编号为CMIDD.2b），购自中国医学科学院皮肤病研究所（南京）。

    1.1.2  临床标本  自2003年2月至2005年2月，在本院门诊和住院病人中采集。

    1.1.3  对照用API－20C鉴定系统  采用法国生物梅里埃产品。

    1.1.4  真菌分离、鉴定检测试剂盒，购自珠海市丽拓发展有限公司。

    1.2  方法

    1.2.1  标准菌株制备  在无菌条件下从真菌标准菌株保存斜面中，用巴氏接种环接种到改良的沙氏琼脂平板上，30 ℃培养24 h~48 h,再转种活化一代备用。

    1.2.2  临床标本的准备  把标本先接种到改良的沙氏琼脂培养基中，30 ℃培养24 h~48 h,再转接活化一代后备用。

    1.2.3  菌型鉴定  从制备好的标准菌株和临床标本分离平板中，分别挑取1个~3个直径大于1 mm拟似菌落，加入到鉴定培养基中，混匀。分别取150 μl加入到检测板的A2~A5，B1~B5鉴别微孔中。

1.2.4  药敏试验  从混有菌落的鉴定培养基中取100 μl菌悬液，加入到药敏培养基中,混匀后分别取150 μl加入到检测板的A6~A12，B6~B12微孔中。

    1.2.5  结果判断  将检测板放入湿盒中,于30 ℃培养20 h~24 h,当B1孔出现明显浑浊时,各微孔加入显色液1滴（B5孔除外），继续培养2 h~4 h观察结果，结果判读参照说明书。

    1.2.6  API20C操作按说明书进行。

    2  结果

    2.1  标准菌株鉴定结果  两种试剂对6株标准菌株检测完全一致,见表1。

    表1  酵母样真菌标准菌株的鉴定结果菌株（略）

    3  讨论

该实验方法集真菌药敏和鉴定于一体，较传统的药敏和鉴定方法节省时间在24 h以上，有利于临床早期判断，早期治疗的原则。本研究发现在真菌药敏和鉴定中，标准菌株及临床标本分离株的活化和接种量对结果有一定的影响。菌株活化以二代左右为宜，以便获得生长力旺盛的纯菌落，同时发现鉴定实验的接种量在104 cfu/ml~105 cfu/ml为宜。药敏试验接种量应控制在103 cfu/ml左右，过高、过低接种量都不利于结果判断。在药敏试验中发现临床感染真菌对咪唑类抗生素出现较多的耐药性［2］，提示与近期临床上大量使用该类抗生素而引起耐药菌株增加有关，值得临床注意。近年来，真菌感染特别是酵母类真菌感染明显增加。随着抗真菌药物数量的增多和耐药真菌的出现，临床上迫切需要对真菌进行鉴定和药敏实验［2］。在国内现有产品中，还没有把真菌鉴定和药敏试验在一个检测板上，同时进行快速检测试剂盒，本实验采用试剂是利用真菌的特殊生化反应和酶反应，用活细胞线粒体酶特征显色剂，对真菌进行快速鉴定和药敏试验，改变了过去通过观察浊度来判断结果的方法，显色反应鲜明，操作简便，判断准确，是一种比较先进的技术方法，值得推广［4］。

作者：肖晋《实用医技杂志》

    参考文献：

［1］  王文莉，郑玮清，李若瑜，等．采用NCCLS M27A方案微量法检测念珠菌对抗真菌药物的敏感性［J］.中国检验医学杂志，2001，24（2）：107108.   
    ［2］  王慧.243株真菌感染菌株的耐药性分析［J］.山东医药,2004，18（20）：5051.   

［3］  刘先宁．眼部常见酵母样菌的快速鉴别及药敏实验方法的建立［J］.现代检验医学杂志，2003，18（2）：3435.

［4］  Tellier R, Krajden M, Grlgorie WGA, et al.Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts［J］. Antimicrob Agents Chemother, 1992, 36(8):16191625.

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