嗜酸乳杆菌对致泻性大肠埃希氏菌上皮细胞粘附和侵袭的抑制作用

【 摘要 】　 目的　研究嗜酸乳杆菌DOM La菌株是否对致泻性大肠埃希菌对上皮细胞粘附和侵袭能力具有抑制作用。方法　使用了Hep-2细胞粘附实验和Hep-2细胞侵袭实验。结果　发现嗜酸乳杆菌DOM La菌株对Hep-2细胞粘附平均达222.48±30.7个细菌/细胞。thyA基因突变菌株DOM LaF84 对Hep-2细胞的粘附为61.96±10.27个细菌/细胞。将嗜酸乳杆菌DOM La菌株与肠产志贺氏样毒素且具有侵袭力的大肠埃希氏菌(ESIEC)F171菌株共同孵育后, 可将后者的粘附和侵袭菌数分别由273.4±24.7个细菌/细胞和13.4±4.9个细菌/细胞，降低到65.3±13.1个细菌/细胞和6.82±1.6个细菌/细胞， 差异有显著性（P＜0.01）。 将DOM La菌株与肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC） 8401菌株共同孵育后，可将后者对Hep-2细胞的粘附和侵袭数分别由269.2±26.5个细菌/细胞和34.0±5.3个细菌/细胞降到70.7±14.0个细菌/细胞和6.82±2.9个细菌/细胞，差异有显著性（P＜0.01）。结论　嗜酸乳杆菌DOM La菌株对ESIEC F171菌株和EIEC 8401菌株的Hep-2细胞的粘附和侵袭能力均具有明显的抑制作用，这可能是嗜酸乳杆菌对感染性腹泻具有非特异性预防和治疗作用的机理之一。

　　Inhibition of adherence and invasiveness of diarrheogenic E. coli to Hep-2 cells by Lactobacillus acidophilus DOM La　FU Xiaoli, XU Jianguo, GAO Shouyi. Priority Laboratory of Molecular Medical Bacteriology, Ministry of Health. Institute of Epidemiology and Microbiology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 102206

　　【 Abstract 】　Objective　To select a L. acidophilus strain which has potential to be used as vector for vaccine development of enteropathogens.Methods　Hep-2 cell culture on cover-slips were incubated with the bacteria to be tested for 3h at 37℃. After incubation the cover-slips were fixed with formalia and stained with Giemsa stain for “Single Bacteria culture” and with Grams stain for “Duel Bacteria culture”. After that the specimen were examed microscopically. Fifty adhered cells were counted for “Bacteria Adherence Test”. For “Bacteria Invasion Test” the co-culture (Hep-2 cells and bacteria) had to be cultivated for further 1h after the previous 3h incubation. There after 50 invaded cells were counted.Results　 Hep-2 cell adherence assay data showed that L. acidophilus DOM La had intensive adhesive ability to Hep-2 cell line. The mean number of adherence of it was 222.48±30.7 organisms/ Hep-2 cell. The thyA mutant derivative strain of it was isolated, named as DOM LaF84, which retained the activity to adherence. The Hep-2 cell adherence and invasiveness of entero-SLTs-producing and invasive E. coli F171 were reduced by L. acidophilus DOM La from 273.4±24.7 organisms/cells and 13.4±4.9 organisms/ cell to 65.3±13.1 organisms/cell and 6.82±1.6 organisms/Hep-2 cell respectively. The Hep-2 cell adherence and invasiveness of enteroinvasive E. coli 8401 were also reduced by L. acidophilus DOM La from 269.2±26.5 organisms/cell and 34.0±5.3 organisms/cell to 70.7±14.0 organisms/cell and 6.82±2.9 organisms/cell.Conclusions　 Based on these results, we concluded that the L. acidophilus DOM La strain has unspecific inhibition effects on the invasiveness and adherence ability of diarrheogenic E. coli, which could be used as a basic feature for development of lactic bacterial vaccine vector system.

　　【 Subject words 】　Lactobacillus acidophilus　　Bacterial adhesion　　Escherichia coli

　　乳杆菌（Lactobacillus）为人及动物肠道正常菌群的重要成员。百年来，人们对其生理调节功能，营养促进作用和非特异性抗感染等方面作了大量的基础和应用方面的研究。乳杆菌本身良好的粘附定植特性是其充分发挥生物学效能的保证。有文献报道^{〔1, 2〕}，不同乳杆菌菌株的粘附特性不同，而且差别很大，某些肠道中的非优势乳杆菌根本没有粘附能力^{〔3, 4〕}。我们筛选出一株对Hep-2细胞粘附良好，且对某些致病性大肠埃希氏菌的粘附和侵袭有抑制作用的嗜酸乳杆菌候选株；现将结果报告如下：

　　材料与方法

　　1.菌株和细胞株

　　菌株：本实验所用菌株见表1。

表1　实验菌株

　　Table 1. Strains and origin

　　* Entero-SLT-producing and invasive E. coli

　　**Entero-invasive E. coli

　　# China General Microbiological Culture Collection Center

　　## National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products　　细胞株: Hep-2细胞株。

　　2.培养基: MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，吐温-80 1ml， K₂HPO₄ 20g，醋酸钠5g，枸橼酸三氨2g，MgSO₄7H₂O　200mg，MnSO₄ 4H₂O 50mg，蒸馏水加至1000ml,pH6.0，LB液体培养基，RPMI 1640和含小牛血清的RPMI 1640。

　　3. 细菌的制备

　　嗜酸乳杆菌：将新鲜接种的MRS平板上的嗜酸乳杆菌单菌落，接种于5ml MRS肉汤，37℃静置培养过夜。以体积分数为2％（原表示为v/v)的MRS菌培养液接种于5ml新鲜的MRS肉汤，37℃静置培养5～7小时后取1.0ml于Eppendorf管中，离心沉淀细胞。以1.0ml含小牛血清的1640液悬浮细胞，使细胞浓度约为10⁷ CFU/ml。

　　大肠埃希氏菌：挑取大肠埃希氏菌单个菌落，接种于5ml LB肉汤，37℃通气培养过夜。以体积分数为2％的LB菌培养液接种于5ml新鲜的LB肉汤，37℃通气培养3小时。处理方法同上。

　　4. Hep-2细胞的粘附和侵袭实验：青霉素小瓶培养的Hep-2细胞，以RPMI 1640洗1次，加入0.9ml含小牛血清的1640液和0.1ml上述制备好的菌悬液，若涉及到两种细菌，则每种细菌各加0.1ml，RPMI 1640液加0.8ml, 使总体积为1ml, 轻轻摇晃混匀。于二氧化碳孵箱，37℃培养3小时。每次实验每份标本同时作3份。

　　粘附试验：37℃培养3小时后，取出盖玻片，晾干，甲醇固定15分钟，单菌粘附以吉姆萨氏染液染色3～4小时，蒸馏水漂洗1次；若涉及到两种细菌，则进行革兰氏染色。干燥后镜下观察，计数50个细胞粘附的细菌数，计数平均值。显微照相并记录结果。

　　侵袭试验：37℃培养3小时后，加含100μg/ml庆大霉素的1640液2ml, 37℃培养1小时。再用RPMI 1640洗3次，取出盖玻片，晾干，甲醇固定15分钟，吉姆萨氏染液染色3～4小时，用蒸馏水漂洗1次，干燥后镜下观察，计数50个细胞侵袭的细菌数，计数出平均值。显微照相并记录结果。

　　结　果

　　1.嗜酸乳杆菌DOM La、DOM LaF84对Hep-2细胞的粘附：从图1可见，DOM La 及DOM LaF84对Hep-2细胞呈弥散性粘附。DOM La的粘附平均每个细胞约为222.5±30.7（计数50个细胞）个细菌/细胞；DOM LaF84的粘附平均每个细胞约为61.96±10.27（计数50个细胞）个细菌/细胞。而DOM La92, L.casei 1.29和L.casei 34103 对Hep-2细胞的粘附特征不明显，图片未显示。

　　2.DOM La 对E.coli F171及E.coli 8401的Hep-2细胞粘附及侵袭的抑制：DOM La分别与E.coli F171及E.coli 8401共同孵育，后两者对Hep-2细胞的粘附细菌数分别由273.4±24.7个细菌/细胞和269.2±26.5个细菌/细胞,下降到65.3±13.1个细菌/细胞和70.7±14.0个细菌/细胞, 差异有显著性（P＜0.01）（表2，图1）。

　　　　　表2　嗜酸乳杆菌对致泻性大肠埃希氏菌Hep-2细胞粘附力的抑制作用

　　Table 2. Inhibition of Hep-2 adherence of diarrheogenic E.coli by L.acid.

　　*The value is statistically significant(P＜0.01)

　　嗜酸乳杆菌DOM La对E.coli F171、E.coli 8401对Hep-2细胞的侵袭力也具有明显的抑制作用（见表3）。与DOM La共同孵育后，E.coli F171及E.coli 8401对Hep-2细胞的侵袭力分别从13.4±4.9个细菌/细胞和34.0±5.3 个细菌/细胞，下降为1.98±1.6个细菌/细胞和6.82±2.9个细菌/细胞，抑制前后差异有显著性(P＜0.01)，见表3、图2。

　　　　　　表3　嗜酸乳杆菌对侵袭性大肠杆菌对Hep-2细胞侵袭力的抑制

　　Table 3. Inhibition of Hep-2 cell invasiveness ability of diarrheagenic E.coli by L.acid.

　　*The value is statistically significant(P＜0.01）

　.

　　讨　论

　　乳杆菌对上皮细胞的粘附是其作为益生制剂和(或)表达细菌保护性抗原的受体菌首先需要考虑的因素之一，也是其充分发挥生物学活性的基础和保障。从我们的实验结果可见，嗜酸乳杆菌DOM La及其thyA缺陷株DOM LaF84对Hep-2细胞均具有明显的粘附性，而另外一株嗜酸乳杆菌DOM La92和2株干酪乳杆菌L.casei 1.29和L.casei 34103对Hep-2细胞的粘附性较弱，或无明显的粘附特征。DOM LaF84菌株thyA基因缺陷后，菌体变粗、变长，但仍具有良好的Hep-2细胞的粘附性。说明thyA基因的改变，对嗜酸乳杆菌的Hep-2细胞的粘附性无明显的影响。

　　DOM La对E.coli F171和E.coli 8401的Hep-2 上皮细胞粘附及侵袭均具有明显的抑制作用(见表1,2)。E.coli F171表达EF/I菌毛，粘附性很强，对细胞呈弥散性粘附，平均每个细胞粘附的细菌数可达273.4±24.7个细菌细胞/Hep-2细胞^〔5〕。E.coli 8401为侵袭性 大肠杆菌的标准株,对Hep-2细胞具有强烈的粘附性。粘附是细菌侵入细胞的第一步，对细菌粘附的抑制可干扰细菌对细胞的侵袭。从我们的结果可见，DOM La对这两种致病性大肠埃希氏菌的粘附和侵袭均具有明显的抑制作用。

　　关于乳杆菌对致病菌粘附及侵袭抑制的机理和物质基础，国内外开展了一些研究，Brooker和Fuller ^〔6〕认为，乳杆菌的粘附可能与粘膜多糖有关。Sherman和Savage ^〔7〕认为磷壁酸与啮齿类组织的粘附相关。Coconnier等^〔8〕，Blemberg等^〔9〕证实蛋白或蛋白样物质与乳杆菌的粘附相关，并分离出相关的蛋白样物质。关于乳杆菌对致病性大肠埃希氏菌的粘附抑制作用的观点也莫衷一是，有人认为与受体有关，或与乳酸菌的细菌素有关，也有报道与两种细菌粘附的空间位阻关系密切。我们的实验结果提示，两种菌之间的空间位阻是抑制病原菌粘附的机制之一，尤其是thyA基因突变菌株的菌体变长，这种由于空间位阻所致的抑制效果更为显著（资料未显示），但也不排除其它因素参与的可能性，如营养竞争、代谢产物的抑制、毒素的产生等。生理性细菌的粘附机制非常复杂，涉及的因素很多，不仅与菌株的来源有关，还与实验材料的选择，实验条件的控制等多种因素密切相关。粘附不仅仅是细菌本身的作用，还与受体细胞的来源及功能状态密切相关，如果在体内，则情况更复杂。有关该菌株的粘附及粘附机制尚有待于深入的研究。

　　本研究对两种革兰氏染色性细菌粘附的显示方法进行了改进，国外报道的有关粘附抑制实验，一般都采用同位素标记^〔8，9〕的方法，即将其中的一种菌以同位素标记，然后用γ闪烁计数器，计数细菌，这种方法操作复杂，实验者要接触放射性物质，同时还需要一定的设备。对于由革兰氏阳性和革兰氏阴性菌组成的竞争性粘附体系来讲，非常方便。操作简单、安全、省时、准确、直观、可控制性好，不需要特殊的设备(如图1)。

　　作者：傅晓丽　徐建国　高守一

单位：傅晓丽(现在工作单位：诺舟生物技术研究所，100093 北京海淀区香山路娘娘府甲2号)；徐建国　高守一（102206 北京，中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所，卫生部医学分子细菌学重点实验室）

　　参考文献

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