柠檬醛抗真菌及抑制黄曲霉产毒的试验报告

摘要：采用平板法比较了柠檬醛与合成食用防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾对5种霉菌和5种酵母菌的抗菌效力。结果表明，在培养基pH4.5时，柠檬醛对多数试验真菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.10％～0.15％，与山梨酸钾的抗菌效力相近，优于苯甲酸钠。在添加0.15％柠檬醛的麦芽汁摇床试验中发现，鲁氏酵母生长曲线的调整期比对照组延长，对数生长期和稳定期缩短，细胞总数减少了55％。同时，柠檬醛与黄曲霉产毒关系的试验显示，柠檬醛对黄曲霉产生黄曲霉毒素具有较强的抑制作用，可以减少81％以上的毒素产生。
关键词：柠檬醛；真菌；抗菌效力；黄曲霉毒素
前言
　柠檬醛系香叶醛(反式甲位柠檬醛，geranial)和橙花醛(顺式乙位柠檬醛，neral)的混合物，无色或微黄色液体，呈浓郁柠檬果香味，是我国允许使用的食品增香剂[1]，而且它还是合成紫罗兰酮系列高级香料的重要原料。柠檬醛有天然品及人工合成两种。天然柠檬醛存在于山苍子油、柠檬草油、柠檬油、白柠檬油、柑桔类叶油等许多种芳香植物的精油中，其中山苍子精油是柠檬醛的最主要来源。山苍子主产于我国长江流域以南及东南亚地区，我国是山苍子精油的最大生产国。
　余伯良(1998)报道，山苍子精油对多种霉菌具有抗菌性，而且对黄曲霉产生黄曲霉毒素有较强的抑制作用。柠檬醛是山苍子精油的最大组分，含量为66％～80％。因此，有必要研究柠檬醛是否抗真菌及其与黄曲霉产毒的关系。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种黄曲霉(Aspergillusflavus)，桔青霉(Penicilliumcitrimum)，总状毛霉(Mucorracemosus)，禾谷镰刀霉(Fusariumgraminearum)，黑根霉(Rhizopusnigricans)，鲁氏酵母(Saccharomycesrouxii)，啤酒酵母(Sacch.ceravisiae)，粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)，浮膜假丝酵母(Candidamycoderma)，异常汉逊氏酵母(Hansenulaanomala)。
　菌种中的黄曲霉、总状毛霉系自制花生酱在28～32℃下敞开放置7d，从表层霉菌中分离、鉴定的主要两株霉菌。其中黄曲霉为产毒菌株，该试样用层析法[3]检测，其黄曲霉毒素B1(AFTB1)含量为5.87mg/kg。其他菌种来源于中科院微生物所和成都生物所，由本院菌种室提供。
1.1.2试剂柠檬醛：采用真空分馏的单离方法从山苍子油中提取，质量符合FAO/WHO(1981)标准(山苍子油购自成都香料总厂，质量符合ISO3214－1974(E)标准；
　1，2—丙二醇、苯甲酸钠及山梨酸钾均为AR级，硅藻土cp级；
　AFTB1标准溶液：购自国内贸易部谷物油脂化学研究所标准室，浓度为1.00ug/mL；
　检测AFTB1的硅胶薄层层析法所使用的仪器和试剂符合GB8381－87标准要求。
1.1.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA琼脂)培养基和麦芽汁培养基。
　花生察氏培养基，配方如下：蔗糖30.0g、K₂HPO₄1.0g、MgSO₄·7H₂O0.5g、NaNO₃3.0g、KCl0.5g、FeSO₄0.01g、ZnSO₄0.4mg、花生水抽提液1000mL及琼脂15.0g，调节pH至5.5(添加ZnSO40.4mg/L对产黄曲霉毒素有促进作用)。
　花生水抽提液制法：挑选新鲜、无霉花生仁200g，浸泡6h，加蒸馏水1200mL，先后用磨浆机、胶体磨研磨成乳浆状，然后用多层纱布过滤，滤纸抽滤，取其滤液1000mL备用(若不足1000mL，须补充蒸馏水至足量)。
1.2方法
1.2.1平板法测柠檬醛的最低抑菌浓度(MIC)　将柠檬醛和苯甲酸钠、山梨酸钾分别用无菌丙二醇和无菌蒸馏水稀释成9.0％、8.0％、7.0％至1.0％共9个重量百分比浓度梯度备用。
　分别挑取经PDA和麦芽汁琼脂活化培养的上述5种霉菌孢子和酵母菌，用无菌生理盐水制成混悬液(霉菌孢子浓度约为1×10⁶个孢子/mL，酵母菌液浓度约为3×10⁵个/mL)。作涂菌用，须在24h内使用。
　分别调节PDA琼脂和麦芽汁琼脂培养基，分装于若干支试管中(每支19mL)。灭菌后待降温至60℃左右，分别吸取柠檬醛、苯甲酸钠、山梨酸钾三种试剂的稀释液1mL加入各自试管中，充分摇匀，于50℃左右倒置平皿，含每种试剂的两种培养基各倒27付(掺入相同浓度同一试剂的同种培养基倒置3付平皿，9个浓度梯度则为27付)。另外3支PDA琼脂和3支麦芽汁琼脂试管各装培养基19mL，不掺入试剂，分别加入1mL丙二醇溶剂，摇匀后倒置平皿作对照(每次试验用对照皿2个，PDA和麦芽汁琼脂各一皿)。
　在每个平皿底部外面用记号笔画“大”字，并作标记。同种试剂相同浓度的两个培养基平皿共接5种霉菌和5种酵母菌(每种菌分别涂在“大”字的5个空隙位置上，切忌混菌污染)。对照组也涂菌，也是两皿涂10种菌。28℃培养48h，观察结果，以肉眼看不到酵母菌菌落、霉菌菌丝生长的最低试剂浓度为该试剂的MIC(做3次平行试验，以2次或3次相同结果的为准)。
1.2.2柠檬醛对酵母细胞生长繁殖影响试验酵母菌是单细胞，可以通过生长曲线的变化来考察柠檬醛对其生长繁殖的影响。我们以鲁氏酵母为例，采用恒温摇床培养，光电比浊法测定OD值(代表增殖细胞总数)，以及美兰染色血球计数板法(测定活细胞)相结合，绘制鲁氏酵母在添加了0.15％柠檬醛的培养基和空白条件下各自的生长曲线。主要步骤如下：
　①将澄清的麦芽汁加水稀释成10°Bx′麦芽汁培养基，自然pH，分装于9个300mL的具有侧臂试管的三角烧瓶中，每瓶装38mL，常规灭菌。其中3瓶为试验组，添加0.15％柠檬醛(即鲁氏酵母MIC低一个浓度梯度)试剂2mL；另外3瓶为不添加任何试剂的试验对照组(在培养基中加入2mL无菌丙二醇)；剩下的3瓶作为测定光密度(OD值)的空白对照。
　②试验组和试验对照组每瓶均接种摇匀的酵母菌液4mL，置于台式万能摇床中，28℃恒温振荡培养。开始时将刚刚接种的培养液摇匀后倾入侧臂试管中，置于自制的“721”分光光度计比色管架上，用721型分光光度计测定菌液(细胞总数)浓度(光密度值)，此时所测读数为“0”时读数值(即接种量)。之后，在恒温振荡培养过程中每隔5h用相同方法测OD值，共测14次，至培养70h为止。比色时，均用无菌的相同培养液作空白对照，予以校正。用560nm波长测定。三次平行实验，求其平均值。
　另外，用显微镜测微尺测定试验组和对照组对数生长期酵母细胞大小，随机各测5个细胞，取其平均值。
1.2.3柠檬醛与黄曲霉产毒关系试验参考“培养皿中荧光反应法”，首先做柠檬醛是否抑制黄曲霉产毒的定性试验。具体做法是：将花生察氏培养基溶化，分别放入若干支试管中(每支19mL)，待降温至60℃左右，各自加入1mL用丙二醇稀释的不同浓度的柠檬醛(体积百分比浓度分别为5.0％、4.0％、3.0％、2.0％、1.0％)，每种浓度加3管。作对照的3支试管仅加入19ml花生察氏培养基和1mL丙二醇。各试管摇匀，缓缓倾入硅藻土薄层平皿中。接种黄曲霉，28℃培养6d后于125W紫外灯下观察(滤光片波长365nm)，如果菌丝体上显现亮蓝紫色荧光则表示有黄曲霉毒素产生(作3次平行试验，以2次或3次相同结果的为准)。选取各试剂阳性平皿中最具代表性的一个平皿(即菌丝生长与对照皿相近，而荧光反应却比对照皿弱的)及丙二醇对照样本，用硅胶薄层层析法分别测定各阳性皿及对照皿中培养基的AFTB1含量。各测2次，取其平均值。
2结果与讨论2.1柠檬醛与合成食用防腐剂的MIC值比较　MIC值越低，表明相应试剂的抗菌效力越强。从表1可知，柠檬醛对10种试验菌(5种霉菌和5种酵母菌)中的7种其MIC值为0.10％～0.15％，其抗菌效力与公认较好的合成食用防腐剂山梨酸钾相近，而优于苯甲酸钠。从柠檬醛对霉菌、酵母菌抗菌效能总体看，柠檬醛对霉菌的抗菌效力比对酵母菌强，此点也与山梨酸钾相似。但是，苯甲酸钠和山梨酸钾都是酸性防腐剂，在基质pH4.5以下时抗菌效力较强，随着pH上升其抗菌效力减弱，当基质pH5.5以上时，苯甲酸钠几乎无抗菌作用，山梨酸钾在基质pH6.0以上时，抗菌效力也相当弱。而柠檬醛对霉菌的抗菌效力受基质pH影响较小，其抗菌活性pH范围较广，在3.5～7.5之间。表1柠檬醛等三种试剂的MIC值（单位：％）

注：培养基pH4.5。

2.2柠檬醛对酵母细胞生长曲线的影响
 　从图1可以看出，空白对照鲁氏酵母的调整期是9h，而含有柠檬醛的培养基酵母菌的调整期是22h，明显延长，超过空白样的1倍以上；空白对照样的对数生长期是21h，而试验样的对数生长期是8h，缩短了1.6倍；空白对照样的稳定期大约是30h，而试验样的稳定期只有17h，缩短了43％。再从对数生长期末细胞总数测定点看，空白对照样的C点OD值是0.49，而对照样的C’点OD值仅0.24，其细胞总数仅相当于空白对照样的49％。　另外，从对数生长期细胞大小测定看，试验样平均细胞大小比空白对照样小18％左右，试验样的细胞发育受到影响。　由此可见，柠檬醛对易引起多种食品腐败变质的鲁氏酵母生长繁殖的影响是显著的：生长适应的调整期延长，对数生长期和稳定期缩短，细胞总数减少了55％，细胞个体平均较对照组为小。酵母菌与霉菌同属于真菌，有一些共同之处，可以推测，柠檬醛对霉菌生长繁殖的抑制也可能有类似情况。2.3柠檬醛对黄曲霉产毒的影响表2柠檬醛对黄曲霉产毒的影响

注：菌丝生长情况：“—”表示肉眼看不到菌丝，无霉斑；“＋”表示能看到稀少的菌丝或发芽孢子，无霉斑；“＋＋”表示能看到较多的菌丝或出现霉斑；“＋＋＋”则指试样表面几乎全部被菌丝及孢子覆盖或出现霉斑。　荧光强弱：“○”为无荧光；“＋，＋＋，＋＋＋”为强度依次递增。黄曲霉毒素B1值为2次平行试验平均值。　从表2可见，添加0.10％、0.05％柠檬醛的花生察氏培养基接种产毒黄曲霉培养6d，其菌丝生长情况与对照组相近，而荧光反应却较对照组为弱，说明柠檬醛有抑制黄曲霉产毒的作用,其中添加了0.10％柠檬醛的试验皿具有代表性(菌丝生长与对照组相近，而荧光反应却较添加0.05％柠檬醛的更弱，说明产毒受到的抑制更强)。　选取添加0.10％柠檬醛的花生察氏培养基的样本及对照组样本，分别用硅胶薄层层析法测定AFTB1。重复一次，取平均值。添加0.10％柠檬醛的花生察氏培养基其AFTB1为1.14mg/kg(检测两次数据分别为1.20mg/kg、1.08mg/kg)，对照组样品AFTB1为6.08mg/kg(5.98mg/kg、6.18mg/kg)。在有利于黄曲霉生长的花生察氏培养基中添加了促进黄曲霉毒素产生的微量元素Zn，在这样的培养基中，由于添加了0.10％柠檬醛使AFTB1的产生减少了81％，可见柠檬醛抑制黄曲霉产毒的效果是显著的。

3结语　天然柠檬醛是山苍子油的最大组分，对多种真菌的抗菌效力与公认较好的合成食用防腐剂山梨酸钾相近，明显优于苯甲酸钠，而且柠檬醛的抗菌活性pH范围较宽广，不仅对酸性食品有效，对中性食品也有效。而且柠檬醛能显著抑制鲁氏酵母的生长繁殖，对多种酵母也有抗菌效力。同时，柠檬醛对黄曲霉产生黄曲霉毒素有较强的抑制作用，可以使毒素的产生减少81％。柠檬醛具有浓郁的柠檬果香味，不仅是很好的食品增香剂，而且还可以作为食品特别是易污染霉菌及黄曲霉毒素的花生、玉米类食品如花生蛋白饮料、花生糖果、花生酱以及玉米快餐食品等的良好防腐保鲜剂。

作者：余伯良  罗惠波  周健  张佳宁  

作者单位：四川轻化工学院 四川轻化工学院 四川轻化工学院 四川轻化工学院

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