微量稀释法对肿瘤患者术后合并感染ESBLs菌株的检测验证

摘　要　目的：用新型微量稀释法对肿瘤患者术后合并感染超广谱β－内酰胺酶菌株进行检测验证。方法：双纸片法初试微量稀释法验证，对27株肺炎克雷伯氏菌和32株大肠埃希氏菌进行超广谱β－内酰胺酶（Extended－Spectrum－Lactamases,简称ESBLs）检测。结果：显示肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌ESBLs携带率分别为14.8％(4/27)和9.4％(3/32)。结论：微量稀释法是一种新型的验证方法，不但可以测ESBLs，还可以同时测多种头孢三代类抗生素的MIC，具有不易漏检，重复性好，准确，操作简便，终点易于判断的优点。

　　关键词：超广谱β－内酰胺酶　双纸片法　微量稀释法　肺炎克雷伯氏菌　大肠埃希氏菌

　　由质粒介导的超广谱β－内酰胺酶（Extended－Spectrum－Lactamases,ESBLs）是一类水解底物谱相当广泛的β－内酰胺酶。与以往常见的由质粒介导的TEM－1，TEM－2和SHV－1β－内酰胺酶不同的是这些ESBLs不仅能水解青霉素和一、二代头孢菌素，还能水解常用的三代头孢菌素如头孢他啶、头孢三嗪、头孢噻肟及氨曲南等，但不能水解头霉素类如头孢西丁和碳青霉烯类如亚胺配能等。近年来已发现能水解头孢西丁的ESBLs，对产生这类酶的细菌目前尚缺乏简单而又特异性高的常规检测法，从而给临床治疗带来一定困难^[1,2]。

　　目前常规体外药敏试验很容易造成ESBLs的漏检，像常见的携带ESBLs的肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌在常规体外药敏试验中常对头孢他啶、头孢三嗪、头孢噻肟及氨曲南敏感而临床使用这些药物治疗感染性疾病时则常导致失败^[2～4]。只有使用ESBLs检测方法才能检测出细菌是否携带ESBLs，常用方法有双纸片法，三维试验，Etest等，需要设备的检测方法像等电聚焦电泳法，分子生物学检测法如限制性内切酶试验、PCR技术、基因序列分析等。

　　为了解肿瘤患者术后合并感染细菌中ESBLs流行的情况，我们采用上述方法中通用而又简便的双纸片法筛选ESBLs阳性的肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌，再用一种新型微量稀释法进行验证，现将结果报告如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　菌株均为我院1997年3月～1997年12月期间从肿瘤患者术后合并感染菌株中分离到的肺炎克雷伯氏菌27株和大肠埃希氏菌32株。

　　1.2　菌株鉴定采用API系统鉴定（Biomerieux,法国）。

　　1.3　双纸片法初筛试验^[2]

　　选用羟氨苄西林加克拉维酸药敏纸片（BBL），头孢他啶，头孢噻肟，氨曲南药敏纸片（自制），按K－B法操作，将羟氨苄西林加克拉维酸纸片贴在MH平皿中央，用两种平皿，一种距其20mm处（以纸片中心为准）等距离贴头孢他啶、头孢噻肟及氨曲南药敏纸片；另一种为距30mm处按上述方法贴纸片；经35℃孵育18～24小时后观察结果，如发现有协同作用，即初步认定ESBLs阳性。质控菌株为大肠埃希氏菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853及肺炎克雷伯氏菌（WHO赠送），后者用来检测克拉维酸是否失效。

　　1.4　ESBLs校正试验微量稀释法（金章医用新技术研究所，天津），该方法采用微量48孔PVC平板进行头孢他啶、头孢噻肟及氨曲南微量肉汤MIC测定（稀释范围均为0.25～30mg/L），以及上述三种药物（稀释范围均为0.06～8mg/L）加克拉维酸组成（克拉维酸浓度为16mg/L）。具体操作方法为先将待测菌株用脑心浸液（Oxoid）增菌4～6小时，然后用麦氏比浊管0.5号进行菌液浓度校正，校正完毕用无菌0.85％盐水稀释100倍后，使用一次性接种器将菌液移种到48孔PVC平板中，最终菌液接种浓度为(0.5～1)×105CFU/L。将试剂盒置于35℃温箱孵育16～18小时观察结果。分别读出头孢他啶（CAZ），头孢噻肟（CTX）和氨曲南（AZT）的MIC以及上述三种药物加克拉维酸（CL）的MIC值，分别用CAZ，CTX，AZT的MIC值除以CAZ＋CL，CTX＋CL及AZT＋CL的MIC值，凡结果≥8者为ESBLs阳性。

　　2　结果

　　凡双纸片法测ESBLs阳性的菌株，经用微量稀释法证实均为ESBLs阳性，具体情况分析如下。

　　27株肺炎克雷伯氏菌对CAZ、CTX和AZT的耐药率分别为14.8％、3.7％和7.4％。ESBLs检测阳性率为14.8％(4/27)。其中同时耐三种抗生素的肺炎克雷伯氏菌有1株，其ESBLs检测阳性。耐CAZ和AZT的细菌有1株，但ESBLs检测为阴性。单耐CAZ菌有3株，其中1株ESBLs检测阳性（图1）。有2株肺炎克雷伯氏菌体外药敏试验显示对CAZ、CTX和AZT均敏感，但ESBLs检测阳性。

图1　图中显示待测肺炎克雷伯氏菌对CAZ耐药，

　　mIC＞32mg/L对CAZ/CL则由于协同作用

　　mIC=4mg/L两者比值＞8说明ESBLs阳性

　　32株大肠埃希氏菌对CAZ、CTX和AZT耐药率分别为15.6％，6.3％和9.4％。ESBLs检测率为9.4％(3/32)。其中同时耐三种抗生素的大肠埃希氏菌有2株，均未检测出ESBLs。同时耐CAZ和AZT菌有1株且ESBLs检测阳性。单耐CAZ菌有1株，ESBLs检测阳性，还有1株ESBLs阳性的大肠埃希氏菌体外药敏试验对CAZ、CTX和AZT均敏感。

　　在双纸片初试中，发现用30mm间距有1株ESBLs阳性肺炎克雷伯氏菌看不到协同作用，用20mm间距纸片检测，显示明显的协同作用（图2,3）。

图2　从图中可以看出ESBLs阳性菌株由于距离较远(30mm)

　　显示阴性结果。平皿中央为羟氨苄西林/克拉维酸纸片。

　　周围分别为头孢他啶(上)头孢噻肟(右)氨曲南(左)

图3与图2比较，同一ESBLs阳性菌株选用20mm距离显示阳性结果，纸片之间出现协同作用

　　3　讨论

　　目前引起世界重视的细菌耐药机制之一就是ESBLs。许多国家如欧洲的德国、法国、英国等，亚洲的日本、韩国、印度以及美国等地区均先后发现达几十种之多的ESBLs，且多存在肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌中，在法国携有ESBLs肺炎克雷伯氏菌的比例1985年为0.75％，1987年为8.4％，1988年就上升到11％^[1,5]。本组刚开始此项工作就发现携有ESBLs的肺炎克雷伯氏菌的比例已高达14.8％，随着抗生素的大量使用，这种升高趋势仍将有所发展，值得临床微生物工作者引起重视。

　　携有ESBLs肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌给目前使用β－内酰胺酶类抗生素治疗带来了一定困难。有资料表明当这些菌株常规药敏试验证实对CAZ耐药而对CTX或AZT敏感时，随着接种菌量的增加CTX和AZT的MIC可以明显增高。动物试验证实在这种情况下CTX或AZT的治疗将导致失败^[6,7]。本文结果也显示出携有ESBLs的肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌对CAZ、CTX和AZT大多呈敏感，只有采取专用ESBLs测定方法才能将其检测出来。

　　从国外资料来看^[2,4,8,9]，临床检测ESBLs常用的方法有双纸片法、三维试验、Etest等。尽管方法不同，但其基本原理一致，就是利用广谱β－内酰胺类抗生素与β－内酰胺酶抑制剂如克拉维酸的协同作用有无来判断细菌是否携带ESBLs。Jarlier等^[8]建议在双纸片法中羟氨苄西林加克拉维酸纸片与头孢三代类抗生素纸片之间的距离以30mm为宜。也有的学者提出当以30mm间距为准的双纸片法阴性时可改用20mm间距为准的双纸片法重复一次^[4]。基于上述观点，我们采用两种间距同时进行，发现当ESBLs阳性菌对头孢三代类抗生素高度耐药无抑菌圈或很小时，用30mm间距的纸片就无法测出ESBLs，而用20mm间距就很易测出ESBLs。反之如果头孢三代类抗生素的抑菌圈较大，则20mm间距相对就会造成抑菌圈过度重叠而不易看出协同作用，这时使用30mm间距的双纸片法就很易看出是否有协同作用，所以我们认为在检测未知菌是否携带ESBLs时应该两种间距同时进行，既提高ESBLs检出率又可缩短患者等待时间，有利于临床医生及时合理使用抗生素。

　　表1，2示Etest采用CAZ和CAZ＋CL在同一个试条上进行检测，该方法操作简便，可同时测出检测菌的最低抑菌浓度（MIC）和ESBLs。缺点是该试纸条只有一种抗生素即CAZ，这样对CAZ高度耐药或MIC小于0.5的产ESBLs菌株，若用该方法可能检测不出来。相比之下微量稀释法不仅能同时检测多种头孢三代类抗生素如CAZ、CTX和AZT和MIC，而且还能用上述三种头孢菌素加克拉维酸同时检测ESBLs，由于三种头孢菌素对检测菌的MIC值不尽相同，当一种抗生素由于MIC值过高或过低不能测出ESBLs时，另外两种抗生素就可能刚好测出ESBLs，以资进行互补，弥补了只用一种抗生素所造成的漏检，可明显提高ESBLs检出率，本实验也证实了这一点。

表1　微量稀释法对4株肺炎克雷伯氏菌ESBLs阳性检测结果

　　CAZ:头孢他啶CAZ＋CL:头孢他啶＋克拉维酸CTX:头孢噻肟CTX＋CL:头孢噻肟＋克拉维酸

　　aZT:氨曲南AZT＋CL:氨曲南＋克拉维酸

表2微量稀释法对3株大肠埃希氏菌ESBLs阳性检测结果

　　微量稀释法操作非常简便，省时省力，重复性好，终点很易判断，但克拉维酸在冰冻液体条件中保存的有效时间较纸片短，因此，使用时应定期进行检测，以免失效，影响结果。

作者单位：天津医科大学附属肿瘤医院细菌室（天津市300060）

　　参考文献

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　　8 Jarlier V,Nicolas MH,Fournier G,et al.Extended broad spectrum β-lactamases conferring transferable resistance to newer β-lactams against in Enterobacteriaceae:hospital prevahence and susceptibility patterns.Rev Infect Dis,1988;10:867

　　9 Thomson KS,Sanders CC.Detection of extended-spectrum β-lactamases in members of the family Enterbacteriaceae:comparison of the double-disk and three-dimensional test.Antimicrob Agents Chemother,1992;36:1887

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