应用和评价一种检测甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的显色培养基

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）已经成为世界范围内医院感染的重要致病菌，而且其引起的社区感染也日益增多，尽管还存在较多争议，基于实验室的方法筛选病人和保健工作者定植的MRSA仍然是限制其扩散、控制其感染的基础。

临床实验室中已经建立了多种方法来检测MRSA，其中最多见的是在培养基中添加了苯唑西林或甲氧西林的培养方法，这种方法可以区分MRSA和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA），目前最常用的培养基是添加了苯唑西林的高盐甘露醇琼脂，但一些研究显示其灵敏性和特异性均具有一定的局限性。改良的苯唑西林耐药高盐甘露醇培养基（ORSAB）因含有氯化锂和多粘菌素并以苯胺蓝作为pH指示剂，所以其选择性更强，但一些使用ORSAB的独立研究发现其在灵敏度和特异性方面仍存在相似的局限性。

对环丙沙星耐药被认为是检测MRSA的替代标记，而且这种药物也被成功的添加入Baird-Parker 培养基和甘露醇肉汤中，但这种方法也有其局限，因为他不能检测出在一些地区存在的对环丙沙星敏感的MRSA菌株。我们的室内实验室方法是使用一种含多粘菌素E、氨曲南、环丙沙星和氯化钠的选择性甘露醇肉汤（SMB），MRSA菌株由于发酵甘露醇或/和海藻糖而酸化酚红从而使其在培养基中肉眼可见，这种方法以前被报道在分离MRSA方面要优于含有环丙沙星的Baird-Parker 培养基和添加了4mg/L苯唑西林的高盐甘露醇培养基。

培养基中添加显色的酶底物已被用来分离金黄色葡萄球菌，同传统的方法相比这种方法具有高度的敏感性和特异性。两项研究报道了使用含有甲氧西林或苯唑西林的金黄色葡萄球菌显色琼脂来分离特定的MRSA菌株：Merlino等在培养基中添加了八种药物发现多重耐药的MRSA可以有效的生长但社区获得性MRSA生长却不充分；Kluytmans等使用了含有4mg/L苯唑西林的金黄色葡萄球菌显色琼脂发现经24小时的培养后它对检测MRSA具有很高的特异性但敏感性较低。上述两项对培养基的评估研究均未使用临床的病理标本。最近另外一种培养基，S. aureus ID ，被用来分离鉴定金黄色葡萄球菌并显示出较高的敏感性和特异性。这种培养基对非葡萄球菌（包括肠球菌）具有高度选择性，而金黄色葡萄球菌在培养基上由于产生α葡萄糖苷酶可形成绿色菌落。本研究的主要目的是采用S. aureus ID建立一种可用来特异性分离临床标本中MRSA的培养基，次要目的是将此培养基和我们的室内实验室方法及其他商业购买的选择培养基进行比较。

材料和方法 培养基 S.auraus ID的成分由法国bioMe´rieux公司提供，按照厂家的说明制备培养基然后冷却到50℃。头孢西丁、甲氧西林和苯唑西林购自英国Sigma化学公司，环丙沙星得自英国Bayer诊断公司。每种药物根据其效价称重并用无菌蒸馏水倍比稀释（浓度范围为320至1.2mg/L），每份稀释液取1ml和19 ml S.auraus ID培养基混合后倒入培养皿，配制好的琼脂平板中每种抗菌药物的终浓度16至0.06 mg/L，含有甲氧西林或苯唑西林的琼脂平皿还需添加入终浓度为2％的氯化钠。同时制备不含有抗菌药物的琼脂平皿作为对照（含有或不含有2％氯化钠）。 ORSAB（CM1008）得自英国Oxide公司，按照厂家说明加入抗生素（SRO195）。CHROMagar Staph aureus干粉（TA677）得自英国M-Tech 诊断公司，加入厂家提供得指定批次的抗生素（X018）制备成CHROMagar MRSA，每个培养皿的琼脂含量为20ml。SMB的制备按照以前的文献报道。

菌株 36株分离自欧洲各地代表最常见类型的MRSA菌株由英国伦敦colindale健康保护机构提供并冻干保存，这些国家包括比利时、芬兰、法国、德国和英国。MRSA菌株NCTC11939作为标准对照。收集的21株MSSA菌株中包括18株连续分离自我们实验室血培养阳性的野生株和另外3株标准对照菌株：NCTC4163、 NCTC8530及 NCTC6571。 将上述每个菌株重新接种到单个哥伦比亚琼脂（Oxide）平板上，在需氧条件下37℃过夜孵育培养，挑取生长出的每个菌株的菌落在无菌去离子水中制成悬液并用Densimat(bioMe´rieux)将菌液浊度校正到1.0麦氏单位，然后用无菌去离子水将每个悬液1：30稀释使其菌液浓度大约为107CFU/ ml 。使用多点接种器（Mast Laboratories Bootle 英国）接种1μl已稀释好的每种菌液到S.auraus ID平板上（内含上述各种浓度的抗菌药物）。将菌液进一步按1：100稀释，然后以上述相同的方式接种，总之，每种待测菌的最终接种量大约为每接种点10000CFU和100CFU，同时所有菌株（包括两种接种浓度）也被接种到CHROMagar MRSA 和ORSAB上。所有培养基在需氧条件下37℃孵育培养48h，在24h和48h后检查培养基并以菌落在培养基上是否生长和显色报告为阳性或阴性。重复操作上述所有试验一次以检验其和重复性。制备大批的含有4 mg/L 头孢西丁的S.auraus ID并于4℃储存8周，同时按上述方法制备和储存CHROMagar MRSA 和ORSAB。分别在第一天及2、4、6、8周后在每种培养基上接种10个MSSA和10个MRSA菌株，接种量为前述的每接种点10000CFU。在24h和48h后检查培养基并以菌落在培养基上是否生长和显色报告为阳性或阴性。重复操作上述所有试验一次以检验其重复性。

临床标本 本次研究中共在我们实验室中收集了747个拭子来筛选MRSA，这些拭子来自205个不同病人如下部位：鼻腔（192）、咽喉（180）、腋部（209）、会阴（119）和伤口（47）。将每个拭子浸入750μl无菌生理盐水（0.85％）搅拌混匀，然后取50μl悬液接种到ORSAB、CHROMagar MRSA和添加了4mg/L苯唑西林S.auraus ID上（MRSA ID），同时取50μl悬液接种于2mlSMB，上述操作确保了每种培养基都接受了相同的标本接种量。所有培养基均在空气中37℃孵育22h至24h后，任何标本在SMB中出现颜色变化（如呈现桔黄或黄色）则取50μl在哥伦比亚血琼脂上传代培养，继续在空气中37℃孵育22h至24h。所有培养皿在培养22至24h时和48h后由两个实验室工作人员判读结果，每种培养基的判读都互相独立不了解其他培养基上的结果。

MRSA的鉴定 MRSA菌株在CHROMagar MRSA 上为紫红色菌落，在MRSA ID 上为绿色菌落，在ORSAB为蓝色菌落，若试验中出现上述颜色变化则为阳性结果并将菌落转种于哥伦比亚血琼脂,无颜色变化的菌落则不做进一步研究。MRSA的确证通过联合试验，包括Slidex Staph Plus 胶乳凝集试验(bioMe´rieux)、试管凝集试验和检测青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的Mastalex 胶乳凝集试验（Mast Laboratories）。哥伦比亚血琼脂上（转种自SMB肉汤）任何像葡萄球菌的菌落也通过上述方法鉴定。表1 质控MRSA菌株在ORSAB、CHROMagar MRSA及添加不同抗菌药物的S.auraus ID上生长和产色的菌株数

 a大接种量指10000CFU/点 b小接种量指100CFU/点 c不含抗菌药物的培养基有无2％氯化钠其结果相同 结果

选择分离MRSA最好的药物 表1显示了添加入S.auraus ID中最佳抗菌药物浓度，这些药物浓度是防止MSSA菌株在孵育48h后生长所需的最小浓度，所有MRSA菌株在未添加抗菌药物的S.auraus ID上生长良好并产生特征性绿色，尽管有两株菌需48h才出现颜色变化。对于大接种量（约10000CFU/点）的MRSA菌株，除了3株菌（对环丙沙星敏感，MIC为0.25 mg/L）外，其他菌株抗菌药物对其生长和颜色变化无影响；对小接种量（约100CFU/点）某些抗菌药物对MRSA菌株的生长具有较大影响，特别是在表现其α葡萄糖苷酶活性方面（表1）。例如甲氧西林、环丙沙星和苯唑西林可分别使26％、26％和34％的MRSA菌株在孵育24h后不形成绿色菌落，而头孢西丁是唯一使所有MRSA菌株均生长而只有1株（3％）MRSA的颜色变化受影响的抗菌药物，基于这些结果，MRSA ID被确定为在S.auraus ID中添加4 mg/L 头孢西丁。

在CHROMagar MRSA上，当大接种量时，所有37株MRSA菌株都能生长且在孵育24h后都形成紫红色菌落（表1）；当小量接种时，35株菌（94.6％）能够生长并在孵育24h后形成紫红色菌落。ORSAB的效果较CHROMagar MRSA差，当大接种量时，只有35株MRSA菌株（94.6％）能生长并在孵育24h后形成绿色菌落；当小量接种时，只有30株菌（81％）能够生长并在孵育24h后形成绿色菌落。三种培养基在4℃储存8周后各项试验结果均一致，如MSSA菌株都被有效抑制，MRSA菌株的生长和颜色形成也未受影响。当试验重复进行时所有的结果发现也均一致。

MRSA ID检测临床标本的评价 来自43个病人的85份拭子在一个或多个培养基上经48h孵育后证实有MRSA菌株生长。所有菌株经Slidex Staph Plus 胶乳凝集试验、试管凝集试验和PBP2胶乳凝集试验均阳性，所有受测试培养基都未分离出MSSA菌株。表2显示了每种培养基分离的MRSA菌株数。在MRSA ID上经22-24h孵育培养后共有68（80％）株分离菌株出现明显绿色菌落，另有8株在孵育48小时后才被检测到，未能检测出的9株菌在MRSA ID上均有少量分离菌落生长，在其他任何琼脂培养基上产生的菌落数也不超过两个，其中有3株菌只有SMB可以分离出。在孵育22-24h后MRSA ID方法要优于分别检测出50个（59％）和53个（62％）分离株的CHROMagar MRSA和ORSAB方法。

在培养22至24h后，MRSA ID的特异性（99.5％）也要高于本研究使用的其他方法（表2），所有琼脂培养基方法的特异性在培养48h后会降低，MRSA ID最显著。在试验中琼脂上产生的任何绿色菌落都应视为阳性结果，大量的凝固酶阴性葡萄球菌只有在培养48h后可产生淡绿色菌落而MRSA菌株在培养48h后产生深绿色菌落，在实践中很容易相鉴别。

表3显示了MRSA菌株的不同分离部位以及不同培养基对不同类型标本的敏感率，如对来自鼻腔拭子的MRSA，培养48h后CHROMagar MRSA、MRSA ID 和ORSAB的敏感率无差别，而对来自会阴拭子的MRSA，MRSA ID的敏感率要高于其他所有培养基，可能是受标本中其他菌种竞争性的影响。表4显示出某些MRSA菌株只能被一种方法检测出及一些病人只能被一种方法检测到MRSA阳性，如85株MRSA菌株中，7株只被MRSA ID在培养22至24h后检测出，而有3个病人只有使用MRSA ID方法培养22至24h后才检测到MRSA菌株，另外有1个病人只有ORSAB法、两个病人只有SMB方法检测出 MRSA阳性。在43个MRSA阳性的病人中12人在CHROMagar MRSA上和SMA中培养22至24h后未能检测出。

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