厌氧菌微量生化板的研制

作者：李建秋　　　吴晓岩　　　熊德鑫　

摘　要：利用预成酶的原理，研制厌氧菌微量生化鉴定板，用国际标准菌株检测其符合率达95.9%，重复率达96.33%。用已知引进参考菌株检测，其符合率达94.84%，重复率达94.33%，而对临床分离的革兰阴性细菌的符合率达81%，对临床分离的革兰阳性细菌符合率达90%，此法效果与国外API-20A产品效果类似，但此法具有快速，操作简便，重复性好等优点，值得在广大临床检测中推广和普及。

　　 关键词：厌氧菌　微量生化板　快速诊断

　　早在70年代，我们就采用微量技术对微生物生化性状进行检测，以鉴定微生物的种属。从简易装置开发原理来说，它大致包括两大类产品，一类属于微量接种生长繁殖，再与培养基底物产生反应而用于微生物的生化性状的鉴定，这类装置与传统的微管法类似，如API微量系统，它就是利用微型杯的塑料板，干燥底物，使用时往杯中滴入菌悬液，经过培养一段时间后，再观察其培养基中指示剂改变情况。API系统根据对不同类细菌鉴定的需要又分成4大类，如AIP-20A系统用于鉴定厌氧菌，API-20C用于鉴定酵母菌，此套系统对厌氧菌鉴定的符合率为(80～90)%。另一大类快速生化检测装置是利用预成酶的原理，根据酶与底物的专一性反应，不需依赖细菌生长，而能快速鉴定厌氧菌的生化性状，如国内熊德鑫教授的微量生化板法。我们依据微量生化板法原理加以改良，开发出“厌氧菌微量生化板”用于部分菌种鉴定，结果报告如下：

　　1　材料与方法

　　1.1　根据资料^［3］　配制简易生化鉴定20A厌氧菌生化板若干。

　　1.2　指示剂的配置　溴麝香草酚蓝-甲基红指示剂，又简称为BTB-MR液，甲基红溶液：称取甲基红20g，缓冲液加入0.02mol/L，NaOH约30ml，不研磨直至甲基红完全溶解，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中放冰箱保存。0.4%溴麝香草芬蓝溶液，称取TBT0.4g，缓冲液加入0.02mol/L naOH约(30～35)ml，研磨直至完全溶解，加蒸馏水至100ml，储存于棕色瓶中放冰箱保存。临用时将上述两种试剂分别用蒸馏水稀释5倍后1∶1混合即可使用。

　　1.3　操作

　　1.3.1　被检菌液的制备　从厌氧培养48h培养物用无菌棉签洗至无菌试管中，测定菌液OD值为4.0～8.0(相当于15亿/ml～30亿/ml)。

　　1.3.2　加入菌液　现将制备菌液置振荡器上振荡(10～20)sec，使其混均后再用灭菌巴氏管将菌液加入微量反应板小孔中，将反应板置湿溶器盒内35℃普通培养箱(4～6)h后观察结果。

　　1.3.3　每次试验都设阴性和阳性对照　阴性对照用PBS液加入，内含指示剂为浅绿色；阳性对照：吲哚试验，具核梭杆菌具核亚种ATCC25586，七叶水解，脆弱类杆 菌ATCC25285，硝酸盐还原：痤疮丙酸杆菌(本室分离株)；触酶试验：使用脆弱类杆菌ATCC25285；尿素酶：使用本室分离的类杆菌。

　　1.4　结果判定

　　1.4.1　糖发酵试验　每个试验孔加入BTB-MR液一滴，砖红色为强阳性(++)，黄色为(+)，绿色为阴性(-)。

　　1.4.2　吲哚试验　加Kovacs试剂1滴，出现粉红色为阳性，无颜色为阴性。

　　1.4.3　硝酸盐还原试验　先加入A试剂(0.5%α-奈胺后加入B试剂(0.8%磺胺酸)各一滴，出现红色为阳性(+)，无颜色为阴性。

　　1.4.4　七叶苷水解　黑色为阳性(+)，无色为阴性(-)。

　　1.4.5　尿素酶　粉红色为阳性(+)，橙黄色为阴性(-)。

　　1.4.6　触酶产生　在甘露醇中滴入10%H₂O₂，产生气泡者为阳性，不产生气泡为阴性。

　　2　结　果

　　2.2　用国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较列于表1中。

表1　国际标准菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化板鉴定结果比较

　　2.2　已知参考菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化鉴定结果比较列于表2中。

表2　已知参考菌株使用API-20A与厌氧菌微量生化鉴定结果比较

　　2.3　对临床革兰阴性菌分离株的鉴定比较列于表3中。

表3　对临床革兰阴性菌分离株的鉴定比较

　　2.4　对临床革兰阳性菌分离株的鉴定比较列于表4中。

表4　对临床革兰阳性菌分离株的鉴定比较

　　3　讨　论　　厌氧菌微量生化板鉴定法是利用预成酶与底物专一反应，不依赖细菌生长既能快速鉴定厌氧菌的生化方法。而API-20A仍然是定量接种被检测菌经48h培养生长后，细菌产生特异性酶与加入底物专一反应使pH改变而引起预先加入指示剂改变颜色，以鉴定厌氧菌的生化性状方法。据

　　adeny使用API-20A鉴定系统证实，其符合率(80～90)%，我们使用API-20A对临床分离厌氧菌株鉴定符合率达(83～86)%，与国外鉴定资料类似。我们使用厌氧菌微量生化板鉴定法鉴定国际标准菌株符合率为95.92%，重复率为96.33%，均优于API-20A鉴定方法，并且此法不仅重复率及符合率高，而且具有快速鉴定特点，一般6h即可观察结果，而API-20A法需48h观察结果；同时厌氧菌微量生化板法不需要厌氧培养，置37℃培养箱中(4～6)h即可观察结果。可见厌氧菌微量生化板鉴定方法不需要特殊培养基，试剂用量少，成本低廉，操作简便，不需特殊仪器，待检菌株悬液且可在冰箱中保存一段时间，结果不影响，而API-20A等以往常规的管生化，操作程序繁琐，观察时间一般48h以上，待检菌株不宜保存，一般需立即进行生化鉴定。当然厌氧菌微量生化板结果受菌液浓度的影响，一般菌液浓度OD值在4.0～8.0(约15～30亿/ml)其反应最佳时间(4～6)h，如菌液浓度低于此浓度则需延长反应时间，如菌液浓度过高，而反应时间又长，则可能出现假阳性而使鉴定的符合率降低。总之两种生化鉴定方法各有利弊，但主快速检测这点来说还是选择厌氧菌生化反应板鉴定方法为好。

　　作者单位：李建秋　黑龙江省医院，150036

　　吴晓岩　黑龙江省医院，150036

　　熊德鑫　北京解放军304医院，100037

　　参考文献

　　［1］Hansen SL,Stewart RJ.J Cline microboiol,1976,4:227.

　　［2］Moore HB,Sutler VL,Finegold SM.J Cline microbiol 1975,7: 15.

　　［3］熊德鑫编译.厌氧菌分离和坚定方法.江西科技出版社出版，1989，9～11.

　　［4］Adney WS,Jones BL.J Cline Microbial,1985,22(67):980

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