培养基成分对彭泽贝母愈伤组织增殖及生物碱含量的影响

【摘要】  　　目的研究MS培养基中大量元素、微量元素对彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量的影响，筛选有利于彭泽贝母愈伤组织生长和生物碱积累的培养基配方。方法采用正交和单因素实验设计，以生长40 d的彭泽贝母愈伤组织的生长率和生物碱含量为指标，评价各因素对其影响的大小。结果各因素对彭泽贝母愈伤组织生长影响大小依次为P>Ca>K>N,对生物碱积累影响大小依次为K>N>Ca>P；培养基中NO3-N含量较高时，有利于生物碱的积累；微量元素缺乏时均有利于彭泽贝母愈伤组织的生长，缺Cu、缺I时不利于生物碱的积累。结论有利于彭泽贝母愈伤组织生长和生物碱积累的最佳组合分别为：N3P1K3Ca2、 N1P2K3Ca1；培养基中大量元素、微量元素对彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量存在一定影响。

【关键词】  彭泽贝母 愈伤组织 生长量 生物碱

　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of large elements, trace elements of MS culture medium on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus ,and to select the culture medium which is advantageous in its growth and alkaloid accumulation.MethodsWith the growth rate and alkaloid content of the 40 days' callus as indexes, single-factor and orthogonal experimental design  was conducted to evaluate the impact of various factors.ResultsThe effect of various factors on the growth of the callus is P>Ca>K>N ,and on the alkaloids was K>N>Ca>P; the alkaloid content was higher when the proportion of NO3-N was higher than NH+4-N；Lacing trace elements were all advantageous in growth of the callus，but lacing I and Cu were not helpful to the accumulation of alkaloids. ConclusionThe best combination of the various factors for the growth and the accumulation of alkaloids of the callus respectively is: N3P1K3Ca2、 N1 P2 K3Ca1； large elements, trace elements of MS culture medium have effects on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus.

　　Key words：Fritillaria monantha Migo;   Callus;   Alkaloids ;   Growth
   
　　江西彭泽贝母Fritillaria monantha Migo主产于江西北部的彭泽、湖口、都昌、九江、瑞昌、修水等县，已被确定为国产贝母属植物在江西的新分布,彭泽贝母作川贝母使用已有多年的历史，现代药理学研究表明，彭泽贝母的药理、药效接近甚至优于几种常用贝母。近年来，其需求量增大，人们过度采挖，导致其野生蕴藏量锐减，加上人工栽培条件严格，有性繁殖年限长，无性繁殖系数低，病虫害防治难等，不能满足人们长期用药的需求。随着近年来对植物生物化学研究的深入，利用植物细胞、组织或器官培养获得并优化药用植物次生代谢产物，以及最终利用遗传工程制取次生代谢产物以满足人类对药用植物的巨大需求，已成为当前药用植物生物技术领域的研究热点。大规模药用植物组织培养技术的成功，使药用植物组织细胞培养技术在中药领域得到了更深的研究和应用。本课题组研究了不同激素组合对彭泽贝母愈伤组织诱导的影响，并对其高产细胞做了筛选［1，2］。本文在此基础上研究了MS培养基中无机成分对其生长及生物碱含量的影响，为进一步工业化生产奠定基础。

　　1  材料与仪器

　　1.1  材料为本实验室继代培养的疏松的彭泽贝母愈伤组织。

　　1.2  药品贝母素甲购自中国药品生物制品检定所，批号：110750-200607；氯仿、甲醇、氨水、溴甲酚绿、邻苯二甲酸氢钾等均为分析纯。

　　1.3  仪器UV7501紫外/可见分光光度计（无锡科达仪器厂）；SW-CJ-2F医用净化工作台（上海博讯）；PB303-N电子天平（瑞士梅特勒）；全自动高压蒸气灭菌锅（上海博讯）等。

　　2  方法

　　2.1  培养条件以MS为基本培养基，NAA 2.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L+KT 0.5mg/L为激素组合置于温度（20±1）℃，光照强度为1 000-1 500lx，湿度为100%光照培养箱内培养。

　　2.2  生长量测定接种和取材前后均称量培养基的重量,计算接种量、收获量和增长率（每个处理3瓶）：接种量=接种后瓶重(g)-接种前瓶重(g)，收获量=收获前瓶重(g)-收获后瓶重(g)，生长率（%）=收获量(g)×100／接种量(g)。

　　2.3  对其生长及生物碱含量的影响以N，P，K，Ca为4个因素，MS培养基中原浓度、1/2浓度、1/4浓度3个水平，采用正交设计L9(34)进行实验（见表1），培养40 d后取出材料，测定生长率和生物碱含量。表1  N，P，K，Ca含量正交设计因素水平表（略）

　　2.4  NH4+-N与NO3-N对愈伤组织生长及生物碱含量的影响培养基中的氮源改用KNO3和NH4Cl，总N浓度不变，研究其不同比例对彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量的影响，处理见表2。表2  铵态N与硝态N对其生长及生物碱含量的影响（略）

　　2.5  微量元素缺乏对彭泽贝母愈伤组织生长及生物碱含量的影响以MS培养基为对照，把彭泽贝母愈伤组织接种到分别不加Fe，Mn，B，Mo，Zn，I，Co，Cu的培养基上，培养40 d后，取出材料测定生长率和生物碱含量。

　　2.6  生物碱的提取与含量测定生物碱的提取与含量测定参考刘红宁［3］、上官一平［4］等的方法，并在此基础上做了改进。

　　2.6.1  试剂的配制pH 5.0邻苯二甲酸氢钾缓冲液：称取4 g邻苯二甲酸氢钾，加热溶解并定容至100 ml，用0.2 mol/L NaOH溶液调至pH 5.0。

    0.04%溴甲酚绿溶液配制：精密称取溴甲酚绿80 mg，加入少量1 mol/L NaOH溶液溶解，定容至200 ml,置阴暗处备用。

　　2.6.2  标准溶液的配制精密称取浙贝甲素0.006 3 g置于25 ml容量瓶中，加氯仿溶解，定容，得浙贝甲素标准溶液。

　2.6.3  标准曲线的制备精密吸取浙贝甲素标准液1，3，5，7，9 ml，用氯仿定容至10 ml,分别置分液漏斗中，加水10 ml，溴甲酚绿溶液2 ml和邻苯二甲酸氢钾缓冲液2 ml，再精密加入三氯甲烷20 ml，密塞，摇匀，静置30 min，分取氯仿层。另取氯仿10 ml，同法操作，所得氯仿层为空白，在411 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=12.071X+0.100 5,R2=0.998 8。见图1。

　　2.6.4  最大吸收波长选择取1 ml标准溶液萃取的氯仿层，照紫外-可见分光光度法在200～800 nm波长范围内进行扫描，此对照品在411 nm波长处有最大吸收峰，故选择411 nm为测定波长。
　　
　　2.6.5  样品处理取彭泽贝母愈伤组织于60℃干燥至恒重，粉碎，过4号筛，精密称取贝母粉末0.5 g，用10%氨水2 ml湿润30 min，加混合溶剂（氯仿∶甲醇=4∶1）20 ml超声提取40 min，过滤，滤液于60°C水浴蒸干，再用氯仿溶解，置分液漏斗中，加水10 ml，溴甲酚绿溶液2 ml和邻苯二甲酸氢钾缓冲液2 ml，再精密加入三氯甲烷（总30 ml），密塞，摇匀，静置30 min，分取氯仿层，并定容至50 ml,另取氯仿30 ml，同法操作，所得氯仿层为对照。

　　3  结果

　　3.1　培养基中N、P、K、Ca含量对愈伤组织生长及生物碱含量的影响见表3。从表3可以看出，处理7愈伤组织增长率最大, 为108.42%,处理3最小,仅为38.11%；而生物碱含量最高的为处理3,含量为0.163%,最小的为处理4，仅为0.04%。通过直观极差比较可知，RP>RCa>RK>RN，RK′>RN′>RCa′>RP′，表明各因素中对彭泽贝母愈伤组织生长的影响大小依次为P>Ca>K>N，而对生物碱积累影响大小则为K>N>Ca>P，有利于彭泽贝母愈伤组织生长的最佳组合为：N3P1K3Ca2，有利于彭泽贝母愈伤组织生物碱积累的最佳组合为：N1 P2 K3Ca1。表3  N、P、K、Ca含量对其生长及生物碱含量的影响（略）

　　3.2  铵态N与硝态N对愈伤组织增殖及生物碱含量的影响见表4。从表4可以看出,处理5彭泽贝母愈伤组织的平均增长率最高为88.92%,即 NH4+/N03-为1/2时，其次为处理3为83.08%,即 NH4+/N03-为2/1时，当培养基中仅为NH4+-N时，增长率只有8.68%，增长率最小的为空白对照，仅为4.67%；当NH4+/N03-为1/2时生物碱含量最高，达到0.164%，培养基中NH4+/N03-为1/2、1/4、仅N0-3-N时，生物碱含量均高于其他处理，在空白对照中生物碱含量最低。由此表明Ｎ源对彭泽贝母愈伤组织的生长分化及生物碱的积累是有一定影响的，只有当不同形态的Ｎ源比例适宜时，才有利于愈伤组织的增殖和生物碱的积累。表4  铵态N与硝态N对其生长及生物碱含量的影响（略）

　　3.3  微量元素缺乏对彭泽贝母愈伤组织增殖及生物碱含量的影响见图2～3。从图中可以看出，缺乏微量元素均有利于彭泽贝母愈伤组织的增殖，其中缺Co时增长率达到128.19%，生物碱含量远远高于对照；缺Zn、缺Fe时生物碱含量最高，达到了0.234%，缺I、缺Cu不利于生物碱的积累。

　　4  讨论
   
　　培养基的组成是植物生长的一个决定因素，不同植物对培养基有不同的要求，并对培养基中的不同成分有不同的敏感性。本试验发现，当MS培养基中NO-3-N的比例增高时有利于彭泽贝母愈伤组织中生物碱的积累。
   
　　微量元素在植物细胞生长中起着不可替代的作用，它们大多是酶的组成成分或活化剂，缺少其中一种就会代谢受阻，但是植物对其的需要量甚微，稍多就发生毒害。本文研究发现当培养基中缺B、缺Zn、缺Cu、缺Mo、缺Co、缺Mn、缺Fe、缺I时均有利于彭泽贝母愈伤组织的生长，但是缺Cu、缺I时不利于生物碱的积累，与近几年研究的植物逆境有利于中药有效成分的积累相一致［5］。

【参考文献】
  　　［1］张寿文,刘贤旺, 黄慧莲，等.不同激素组合对彭泽贝母愈伤组织诱导效应的研究［J］.江西中医学院学报,2004, 16(4):52.

　　［2］张寿文,雷志强,刘华，等.彭泽贝母组织培养和高产细胞系筛选研究［J］.江西农业大学学报,2007,29(1):152.

　　［3］刘红宁, 颜冬梅,朱卫丰，等.HPLC-ELSD测定彭泽贝母中浙贝甲素和浙贝乙素［J］.中草药，2006,37(4):600.

　　［4］上官一平,傅静芝.酸性染料比色法测定川贝母中贝母素甲含量［J］.中南药学,2006，4(2):130.

　　［5］黄璐琦,郭兰萍.环境胁迫下次生代谢产物的积累及道地药材的形成［J］.中国中药杂志,2007,32(4):277

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