中华人民共和国国家标准
公共场所茶具微生物检验方法大 肠 菌 群 测 定GB/T 18204.3-2000
Methods of microbiological examination for tea set in public places
- D et er m in at ion o f C ol ifo rm bacteria
1范围
本标准规定了公共场所茶具大肠菌群的测定方法。
本标准适用于公共场所内公用茶具大肠菌群的测定。
2定义
本标准采用下列定义。
大肠菌群coliform bacteria
指一群在37`C,24 h培养能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价被检物的卫生质量。
3仪器
3.1高压蒸汽灭菌器。
3.2干热灭菌箱。
3.3培养箱:36℃士I'C。
3.4水箱。
3.5电炉。
3.6天平。
3.7灭菌平皿:直径9 Cm,
3.8灭菌刻度吸管:1 ML，10 ML,
3.9灭菌棉拭子。
3.10灭菌剪刀。
3.11 PH计或精密PH试纸。
4培养基和试荆
4. 1乳搪胆盐发酵培养液
4.1.1成分:蛋白胨20 g
猪 胆 盐(或牛 、 羊 胆 盐)5g
乳 糖10g
0.04 %嗅 甲 酚 紫 水 溶 液25 mL
蒸 馏 水 1 000 mL
4.1.2制法:将蛋白脉、胆盐及乳糖溶于蒸馏水中，调pH至7.4,加澳甲酚紫溶液，混匀，分装到带有倒管的试管中，每管10 mL。以115 `C高压灭菌15 min。
注:双 料 乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
4.2伊红美蓝琼脂
4.2.1成分:蛋白胨10g
乳 搪10 g
磷 酸 氢 二 钾2 g
琼脂17g
2%伊 红 水 溶 液20mL
0. 65 %美 蓝 溶 液 10 mL
蒸 馏 水1 0 00mL
4.2.2制法:将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，调pH至7.1，分装到烧瓶内。121`C高压灭菌15 min备用，临用时加人乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55`C，加人伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
4.3乳糖发酵管
4.3. 1成分;蛋白胨 20 g
乳糖 10g
0. 04 %澳 甲 酚 紫 水 溶 液25 mL
燕 馏 水1 0 00mL
4.3.2制法:将蛋白陈及乳糖溶于水中，调pH至7.4，加人指示剂，分装到带有倒管试管中，每管3 mL,115 C高压灭菌15 min,
4.4革兰氏染色液
4.4.1结晶紫染色液:
结 晶 紫1g
95 %乙 醇 20 mL
1%草 酸 钱 水 溶 液 80 mL
将 结 晶 紫溶于乙醇中，然后与草酸钱溶液混合。
4.4.2革兰氏碘液:
碘 1g
碘 化 钾 2g
蒸 馏 水 300m1
将 碘 与 碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL,
4.4.3脱色液:
95 %乙 醇
4.4.4沙黄复染液:
沙 黄 0.25g
95 %乙 醇 10 mL
蒸 馏 水 90 mL
将 沙 黄 溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
4.5染色法
4.5.1将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染色1 min，水洗。
4.5.2滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。
4.5.3滴加95%乙醇脱色，约30 s，水洗。
4. 5.4滴加复染液，复染1 min，水洗，待干，镜检。
4.6染色结果
革 兰 氏 阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
4.7大肠菌群快速检验纸片
4.7.1质量要求:纸片必须符合食(饮)具用大肠菌群快速检验纸片质量标准。
4.7.2质量标准:每张纸片5 cmX5 cm,pH值7. 0-7.4，包装无菌，生产厂家经卫生部门审核认可。
5检验程序
大肠菌群检验程序如下:
6操作步骤
6.1采样方法
6.1.1随机法:随机抽取清洗消毒后准备使用的茶具
6.1.2涂抹法:使用测定细菌总数时采集的样品，无需重采。
6.1.3纸片法:用灭菌生理盐水湿润5 cmX5 cm大肠菌群快速测定纸片两张，分别粘贴在茶具内、外缘口唇接触处，约30 s后取下，置于无菌塑料袋内。
6.2检验方法
6.2.1发酵法
6.2.1.1用测定细菌总数剩余的检样，倒人双料乳糖胆盐发酵培养液中。置36℃±1'C培养箱内培养24 h,
6.2.1.2观察是否产酸、产气，若有变黄和气体产生，该管推测性检验阳性。
6.2.1.3如不产酸、不产气则为大肠菌群阴性。
6.2.1.4自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，转种伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1'C培养箱培养18-24 h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实性试验。
6.2.1.5在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行染色镜检;同时接种乳糖发酵管，置36℃±1'C培养24 h。
6.2.2纸片法
将 已 采 样的纸片置36℃士1'C培养箱内培养16^-18h，观察结果。
7结果报告
7.1发酵法
凡 乳 糖 发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告检出大肠菌群。
7.2纸片法
纸 片 保 持紫蓝色不变，则报告为大肠菌群阴性;纸片变黄，并在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕，则报告检出大肠菌群。
下一篇：紫丹活血片微生物检查方法学验证
