绿脓杆菌对抗生素的多重耐药的机制研究

录入时间:2010-11-25 9:53:57 来源：CNKI

绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa,PA）感染是目前各种医院内感染中最广泛、最严重的问题之一。有报道它所引起的院内感染约占10%～35%，居病原菌之首。临床上发现，某些细菌或细胞（如某些癌细胞）对多种药物天然耐药，也有些在使用单一药物时出现对多种不同类别的药物同时耐药，这就是所谓的多重耐药性，即细菌或细胞同时对多种结构完全各异的药物耐药。PA为一种条件致病菌，毒力不强去天然具有这种多重耐药特性，而且在某种条件下（如使用抗生素），此特性可增强，给临床治疗带来很大困难。所以，人们试图通过研究其耐药机制，以寻找解决此问题的方法。
80年代以前，人们认为PA的耐药机制主要为： ① 酶的形成（如β内酰胺酶等）； ② 靶位的改变（如青霉素结合蛋白的改变）； ③ 膜通透性的降低。但酶的形成与靶位改变只能形成对某一类抗生素的多重耐药。外膜通透性的降低，使抗菌药物不能进入菌体，与PA的多重耐药性关系较大。但从理论上分析，即使外膜通透性降低，药物亦可逐渐通过外膜进入菌体内并达到一定的浓度，故难以外膜的低通透性来解释全部现象。20世纪80年代，Levy等发现，大肠杆菌质粒介导的四环素耐药性系能量依赖性主动外排泵将四环素排至胞外的结果。主动泵出系统的提出给人们研究PA多重耐药机制提供了一个新思路。目前发现，PA的多重耐药性主要由于外膜的低通透性与主动泵出系统的协同作用引起，而主动泵出系统起主导作用。
　　外膜通透性
　　大多数革兰阳性细菌有一层很厚的肽聚糖细胞壁，其机械性强且通透性高。而革兰阴性细菌具有另外一种结构，其外膜的外叶层由特殊的脂多糖组成，其中的脂肪酸链均为饱和性的，且内含多个共价键，所以外膜的通透性差，具有非常有效的通透屏障作用，特别是对亲脂性抗生素。由于细菌的生长需要从外界吸收营养物质及排出代谢产物，所以在外膜有一些穿通脂双层结构的蛋白即微孔蛋白，它们可构成三面体，中间形成微小通道，允许水溶性小分子通过，以进行细胞内外的物质运输与交换。亲水性化合物可通过微孔蛋白的特异亲水性通道跨越外膜，而亲脂性化合物则藉扩散而通过脂双层结构。某些β内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、氯霉素及喹诺酮类抗生素分子不大，有强烈的亲水性，估计能很快穿透膜孔道蛋白通道，故对许多革兰阴性细菌十分敏感，而PA仅有低效率的微孔蛋白，小分子药物穿透其微孔蛋白的速率只有一般革兰阴性细菌的百分之一，如Augus等发现PA的外膜通透性仅为大肠杆菌的1%～8%。PA的天然多重耐药性显然与此有关。但细菌的生长需要通过外膜与外界进行物质交换，若外膜的通透性过于降低，使物质交换严重抑制，也不利于细胞的生长，所以细菌不可能通过大幅度降低外膜的通透性以增强其耐药性，这难以解释PA获得性多重耐药的形成。另外，从理论上分析，即使细菌外膜通透性降低，药物亦可透渐通过外膜达到平衡[1]。只有进入胞内的药物被降解或灭活时，外膜的低通透性才对其耐药性产生明显的影响，这似乎提示PA的多重耐药是外膜低通透性与酶的协同作用的结果。但有许多新的β-内酰胺类抗生素并不诱导产酶，而它们对β-内酰胺类的抗生素仍然高度耐药。由此可见，在PA的多重耐药机制中，必然有其它耐药作用参与，这就是Levy等发现的主动泵出系统。
　　主动泵出系统
　　主动泵出系统广泛存在于革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌）、革兰阴性菌（如大肠杆菌、PA、空肠弯曲菌等）、真菌及哺乳类细胞（如癌细胞）中[2]，在多重耐药中起重要作用，愈来愈受到重视。
PA的主动泵出系统主要有以下三部分组成： ① 外膜蛋白：如OprM、OprJ、
OprN等[3，4]，形成门通道，使药物排到菌体外。 ② 内膜蛋白：如MexB、MexD、MexF等[5]，为主要的泵出蛋白，具有识别药物的作用，但这种识别不具有特异性。 ③ 膜融合蛋白：如MexA、MexC、MexE等[3，4]，能连接内、外膜蛋白，与它们一起形成可能是连续的通道并开口于外膜的复合体，使药物直接泵到菌体外。主动泵出系统运行所需能量由氢离子药物反转运体逆转H+，形成H+浓度差而产生的势能所提供。
PA具有复杂的多重耐药系统，而且同一耐药突株可能同时存在着多个耐药系统。目前研究较多的是分别由MexAB-OprM[6]、Mexcd-O-prJ[7]和MexEF-OprN[8]操纵子基因所表达的主动泵出系统。这三个操纵子具有高度的同源性，其中，MexAB-OprM广泛存在于野生菌株中，与外膜低通透性一起决定了该菌天然的多重耐药性。在各种诱导因素（如应用抗生素）的作用下，操纵子基因失去抑制而过度表达，明显地增强了操纵子所编码的主动泵出系统，从而形成获得性多重耐药。
　　最初由Poole等报道的基因OprK实际上编码着OprM而并非OprK外膜蛋白。故一度命名为MexAB-OprK的操纵子已重新命名为MexAB-OprM[9]。其在生理条件下的阻遏蛋白为MexR基因所编码的产物，MexR的突变株导致MexAB-OprM脱抑制而表达增强，从而形成获得性耐药。此泵出系统的作用增强与四环素、氯霉素、β-内酰胺类、大环内酯类、TMP、新生霉素等抗生素的耐药有关[10]。Mexcd-OprJ和MexEF-OprN操纵子基因在一般的实验条件下并不表达，即在PA的野生株中，不存在这两种主动泵出系统，所以它们与此菌的天然多重耐药无关。但当其过度表达时（如MexCD-O-prJ在nfxB突变株中，MexEF-OprN在nfxC突变株中），则参与PA的获得性多重耐药的形成。目前发现，MexCD-OprJ的表达，会使PA对喹诺酮类、大环内酯类、新霉素、四代头孢类等抗生素的敏感性明显降低，对四环素、氯霉素的耐药性也稍增加。Gotoh等[11]发现表达MexC、MexD、OprJ的菌株对广谱头孢类抗生素的耐药性也增加。而MexEF-OprN在nfxC中表达，会使PA对氯霉素、TMP、喹诺酮、亚胺培南等抗生素的耐药性增加[8]。
　　最近发现[12]，TonB也与PA的主动泵出有关，参与PA的天然和获得性耐药的形成，但在多重耐药机制中不占主导地位。TonB基因广泛存在于革兰阴性菌中，但在PA中较独特。因为它所编码的蛋白含有突出的N-末端并质膜上，C-末端伸展在周围间隙中，在这里经过能量活化后，可与外膜受体结合。在生理条件下，可把铁转运体[13]、维生素B12[13]、血红蛋白[14]、铁蛋白[15]等转运到体内。最近有资料表明MexAB-OprM系统的运行部分地依赖能量偶联蛋白TonB蛋白，也就是说在外膜门通道OprM打开时，需要Fe3+通过PA的外膜而被吸收。另外，TonB基因的缺失，会使PA对许多抗生素的敏感性增加，这与MexAB-OprM缺失的突变株相似。为研究TonB基因在PA耐药机制中的作用及其与MexAB-OprM操纵子的关系，Zhao等[12]做了一系列实验并发现： ① 四环素在K1040株（TonB缺失株）中的浓度高于PAO6609（TonB表达株）； ② 加入CCCP（一种能量抑制剂）后，此两株菌体内的药物聚集量均增加； ③ K880 株（MexAB-OprM缺失）菌体内的药物浓度高于K1040。 ④ 在K103株（MexAB-O-prM,MexCD-OprJ均缺失）中，若去除TonB基因，则菌体内积聚的药物浓度最高。说明TonB与MexAB-OprM一样为PA的另一主动泵出系统，参与PA的天然与获得性多重耐药的形成。另外的实验还证明TonB的缺失，会使PA对四环素、氯霉素、喹诺酮类、大环内酯类、β-内酰胺类等抗生素的敏感性增加。TonB对MexAB-OprM和MexCD-OprJ操纵子基因所编码的主动泵出系统有协同作用，但后者的运行并不完全依赖于它，TonB基因的缺失可能通过某些尚未了解的机制间接影响MexAB-OprM这个主动泵出系统的活性。
OprM基因产物是最近发现的另一具有主动泵出作用的蛋白，但其作用机制及其作用过程中是否需要其它膜成分的参与，目前还不清楚。Zhao等[16]在MexAB-OprM缺失的PA突变株中引入OprM，发现该菌株对喹诺酮、红霉素、四环素、先锋霉素的耐药性增加；MexAB-O-prM+（MexAB基因缺失，OprM基因保留）株与MexAB--OprM-（MexAB与OprM基因都缺失）株相比，前者菌体内的抗生素浓度明显为低，但加入能量抑制剂CCCP后，MexAB--OprM+株内抗生素的量明显增多。说明在无MexA和MexB蛋白存在时，OprM表达蛋白可通过能量依赖的外排机制引起对一系列抗生素产生耐药，也可能属于主动泵出系统。但Wong等[17]在PA野生株中，通过克隆基因使OprM单独过度表达，其MIC并没有明显变化。另外，在MexAB-OprM缺失的不同菌株中引起OprM后，对氯霉素的耐药也无明显变化。所以，OprM在耐药机制上的作用还需进一步研究。
　　虽然，在多种耐药机制中，膜通透性与主动泵出系统起重要作用，且主动泵出系统占主导地位。但具体对某一类抗生素来说，PA的耐药机制中不一定都是主动泵出系统占重要作用。如对亚胺培南的耐药主要由于OprD蛋白缺失引起[18]；对喹诺酮类抗生素的耐药主要是由DNA解旋酶中gyrA基因突变引起[19]；在对氨苄西林、头孢噻啶等抗生素的耐药机制中酶的形成（如β-内酰胺酶）起决定性作用[20]。
　　有关PA的多重耐药性，仍存在许多问题有待探索，如主动泵出系统的作用方式，OprM的耐药机制，TonB与MexAB-OprM系统的活性的关系，各泵出系统之间的相互关系等等。另外，对PA耐药性的防治对策方面的研究进展较缓慢，还需深入，以便为临床制定合理的给药方案和开发治疗PA感染的有效药物提供有效依据。
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