【摘要】 杜鹃花(Rhododendron)的组织培养受基因型、外植体的来源、培养基种类、培养条件、生长调节物质、培养程序等诸多因素的影响，故具有一定的复杂性。文章概述了影响杜鹃花组织培养的关键因素：外植体种类，外植体消毒灭菌的方法，基本培养基的选择，根的诱导方法等的国内外研究现状，以期能给杜鹃花的组培研究带来一些借鉴价值。
【关键词】 杜鹃花; 组织培养
Abstract：Genotype, explants source, the type of media, culture conditions, growth regulators, culture procedures and other factors all have influence on the tissue culture of Rhododendron. So it has a certain complexity. In order to give some reference values to the tissue culture research,the paper reviewed the key factors influencing the tissue culture of Rhododendron at home and abroad,including the type of explants, sterilization methods to explants, choice of the basic medium, rooting and so on.
Key words：Rhododendron; Tissue culture
杜鹃花(Rhododendron)简称杜鹃，为杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)常绿落叶小灌木，是闻名于世的名花之一，不仅在园林中有很高的利用价值，还可入药以治疗疾病。野生杜鹃多为杂合体，种子繁殖后代发生严重分离，通常靠扦插繁殖，产量有了提高，但生长周期长，繁殖系数低，同时受母株材料和繁殖季节的影响，不能满足社会需求。采用组织培养的方法进行大量快速繁殖是实现工厂化生产的有效措施。
在杜鹃离体繁殖中，试管苗的增殖与生根不仅与植株的基因型有关，还受外植体的来源、培养基种类、培养条件、生长调节物质、培养程序等诸多其它因素的影响，故对近三十年来(1975～2008)国内外杜鹃组织培养研究概况进行综述，以期能给杜鹃花的组培研究带来一些借鉴价值。
1 外植体种类
杜鹃花是多年生木本植物，由于多毛、多鳞片、发粘、材料大而消毒困难，因此大多数组织培养外植体取自幼嫩的组织，染菌较少，消毒容易，易于分化形成愈伤组织或直接分化成芽。通常培养杜鹃可采用的外植体有顶芽，腋芽，雌蕊，带腋芽的嫩茎段以及嫩叶。
1975年，Anderson等[1]以杜鹃茎尖培养植株获得成功。1999年宗宪春[2]培养毛叶杜鹃R. championae与比利时杜鹃R. hybridun采用新发幼苗新梢。2001年钟宇[3]以不同季节的茎尖(含茎段)为材料，培养西洋杜鹃R. hybridn，结果表明，最适外植体为摘花芽后萌发的顶芽茎尖。2003年王亦菲等[4]对两种来自比利时的高山西洋杜鹃R. britannia，R. america的茎尖进行了成功培养。2003年梁晓华等[5]对亮毛杜鹃R. microphyton的茎尖进行了培养，但成功率不高。2004年闫凤霞等[6]选取杜鹃花R. simsii茎尖、嫩叶和老叶为外植体，诱导不定芽产生再生植株，结果表明茎尖、嫩叶效果较好。
1982年Meyer等[7]以花芽作外植体，成功培养了Nova Zembla，RoseumElegans，Sefon等品种的杜鹃。
1986年，从毛叶杜鹃R. mollicomum叶片培养得到植株[8]。1991年报道了以叶为外植体，离体条件下诱导杜鹃R.‘P.J.M. Hybride’植株再生[9]。1996年，从杜鹃R. simsii7个栽培品种Paloma，Avenir，Mme. Petrick，Aline，Flamenco，Lara和 Mme. M. DePaepe 叶片诱导植株，该试验从叶片诱导出了不定芽，但在进行生根诱导培养时未获得成功[10]。2003年秦静远等[9]从R. simsii品种“Hellmut Vogel”幼叶诱导出愈伤组织，并进一步分化为丛生苗。
1987年有报道从子房组织诱导杜鹃R. prinophyllum再生[8]。
1985年，有人培养春鹃和西鹃茎尖成功率仅4%～5%，后用种子无菌苗茎段培养获得成功。1991年，从茎段再生杜鹃R. laetum× aurigeranum获得成功[8]。2002年邓百万等[10]对比利时杜鹃的幼茎进行培养，使休眠腋芽萌发，且诱导出不定芽，并从幼叶诱导出愈伤组织。2004年，汤桂钧等[11]以德国产高山杜鹃R. lapponicum的茎段和茎尖进行外植体诱导试验，结果显示，茎段诱导无菌芽效果较好。2006年朱春艳等[12]以新发茎段为外植体，研究了云锦杜鹃R. fortunei的组培快繁技术，取得成功。2007年，罗彭等[13]以幼嫩茎段为外植体对大白杜鹃R. decorum、美容杜鹃R.calophytum、喇叭杜鹃R. discolor进行组培研究，效果较好。2008年程雪梅等[14]以马缨杜鹃R. delavayi的种子萌发的无菌苗茎段为外植体进行研究，获得成功。
1993年有报道从雄蕊诱导杜鹃R.‘P.J.M.’再生植株和器官发生[13]。
总结以上表明，最优良的外植体是旺盛生长季节(3月下旬到4月上旬)杜鹃新发枝的幼嫩芽[15]，这个时期外植体处于旺盛的生长状态而且芽的苞片还未展开，将带苞片的芽进行消毒，即使灭菌时间长一些也不会伤害到里面的茎尖生长点，接种后成活率高，增殖速度快，褐变程度轻。
2 外植体消毒灭菌的方法
在对三叶胶初级培养污染的研究中发现高温、多雨的环境易导致污染，而且随着植物材料年龄的增长，植物材料的健康状况不断恶化，组培污染也会更加严重，研究认为外植体带菌多少的顺序为：腋芽<茎尖<顶点[16]。外植体的状况、环境条件和操作过程是引起污染的主要原因。对大多数植物来说，采用新生的或新抽的枝条，4～5月份的新叶、茎尖、枝条，污染率可下降20%～30%。
杜鹃外植体消毒困难，腋芽，顶芽和雌蕊等幼嫩部位若消毒时间过长，容易死亡，若消毒时间缩短，则菌尤其是内源菌难以杀死。大多研究者采用自来水冲洗外植体5～30 min，饱和洗衣粉水洗5～30 min，自来水冲洗5～30 min，在无菌条件下用浓度70%酒精消毒15～30 s，无菌水冲洗1次，再用浓度0.1%HgCl2消毒5～8 min，无菌水冲洗4～10次。也有不经过70%酒精步骤，只用HgCl2消毒的。
2003年梁晓华等用浓度10%H2O2，2%Br2，2%NaClO，0.1%HgCl2各浸泡10 min，对亮毛杜鹃进行消毒灭菌比较实验，发现浓度0.1%HgCl2消毒灭菌效果最好。2005年邱璐等用浓度0.2%HgCl2代替0.1%HgCl2消毒2～3 min，取得较好效果。0.2%HgCl2优于0.1% HgCl2的原因在于高浓度的HgCl2能迅速杀死外植体表面的微生物，达到迅速杀菌的作用;另外由于灭菌时间较短，仅2～3 min，消毒剂对外植体细胞的损伤小，外植体易于恢复生长。2003年，陈新平等[17]在进行R. simsii Planch组织培养研究时发现，外杀菌能力较强的升汞液(氯化汞)对杜鹃花的嫩茎具有较强的损伤，外植体材料易褐变死亡，故不宜使用。该实验表明，采用饱和的次氯酸钙上清液或5%的次氯酸钠溶液灭菌，效果较好，处理时间为15～20 min。为加强灭菌效果，还可加入1%的克菌丹和0.1%的Twine-20配合使用，并且证明材料灭菌前的预处理，采用70%酒精浸泡，处理时间不超过30 s效果更好。2003年，秦静远采用10%的次氯酸钠溶液进行消毒。2004年，黄萍萍[18]用5%次氯酸钠溶液浸泡15 min进行消毒。2006年， 在高山杜鹃R. Delavayi的组织培养关键技术研究中，首次采用把茎段先在洗衣粉液浸泡20 min，流水冲洗至清，再用1%的84消毒液振荡15min，以达到清除污垢，还对茎段和茎尖进行了消毒效果的比较实验，主要比较在消毒时间及消毒条件相同的情况下，5%次氯酸钠+0.1%的山梨糖醇浸泡15 min和0.1%升汞浸泡10 min的效果差别，结果发现，用升汞对杜鹃进行消毒，污染率低，但会加重外植体的褐化程度，尤其是成年型外植体，褐化率可达60%以上，因此，作者建议采用5%次氯酸钠+0.1%的山梨糖醇对外植体进行消毒(何芳兰)。2008年，官汝淳等[19]用5%青霉素溶液浸泡10min代替0.1%HgCl2进行消毒。
总的来说，杜鹃花的新茎柔嫩度高、酚类物质含量高，处理时宜采用氧化性较低的灭菌剂类型。外植体大小对实验有很大影响，外植体太大，给消毒灭菌带来困难，消毒不彻底;但外植体太小，容易受消毒液损伤，难以恢复生长。消毒完后，在超净台上将腋芽，顶芽，雌蕊，带腋芽的嫩茎段的切口上面被损伤的细胞切除，再进行接种。嫩叶则要去除叶脉及叶边缘损伤细胞，然后切成适当的大小，再进行接种。
3 基本培养基的选择
1975年Anderson等人总结出可广泛应用于杜鹃属组培的Anderson培养基。1985年，用Anderson培养春鹃和西鹃种子苗切段获得成功[15]。2003年孙振元等[20]以Anderson改良的杜鹃花培养基对毛白杜鹃R. mucronatum进行组培，效果好。
1980年，木本培养基(woody plant medium，WPM)被研制出，这种培养基对培养杜鹃科的一些木本植物非常有效[15]。秦静远用WPM培养基诱导杜鹃的叶片，获得再生植株。2004年，苗永美对大树杜鹃R. protisum， 桃叶杜鹃 R.anne和银叶杜鹃R.argyrophyllum的叶片愈伤组织诱导进行研究，得到最佳培养基为WPM(四川农业大学硕士学位论文，2004)。2006年朱春艳等以WPM为基本培养基，研究了云锦杜鹃R. fortunei的组培快繁技术，效果好。2008年程雪梅等以WPM为培养基，成功进行马缨杜鹃R. delavayi的组培研究，取得成功。
1984年采用Read培养基培养耐寒落叶杜鹃[15]。用Read培养基培养锦秀杜鹃R. pulchrum、映山红R. simsii、迎红杜鹃R. mucronulatum，成功获得再生植株。2001年，钟宇用这种培养基成功培养了西洋杜鹃。2003年，王亦菲等以西洋杜鹃的两个栽培品种R. britannia和R. america为供试材料，比较MS，Anderson，Read，N6 4种基本培养基对外植体诱导的影响，研究结果表明Read培养基表现最为出色，诱导率达85%。
1986年培养春夏杜鹃R.indicum选用1/4MS[15]。2008年顾地周等[21]用1/4MS培养基为基本培养基对牛皮杜鹃R. chrysanthum进行组织培养与快速繁殖的研究。2004年，闫凤霞等选取1/4MS型培养基来进行杜鹃花R. simsii & R. spp.的快繁生产。2004年，黄萍萍采用高山杜鹃R. delavayi茎节为初代培养的外植体， 筛选出相对较优的培养基为1/ 4MS。2007年周艳等[22]以1/4MS培养基为基本培养基，对马缨杜鹃R. delavayi进行研究。2008年，官汝淳等培养短果杜鹃R. brachycarpum，采用的芽诱导和增殖培养基为MS，壮苗生根培养基为1/4MS，成活率达90%以上。
1999年培养毛叶杜鹃与比利时杜鹃时选用B5培养基[15]。
2002年邓百万用Anderson，Read，N6培养基(MS大量元素、B5培养基的维生素、MS铁盐、Read微量元素)为基本培养基培养比利时杜鹃，发现3种培养基均能诱导腋茎萌发、不定芽形成及愈伤组织的形成，其中以N6培养基为优，最适合比利时杜鹃生长。
2003年梁晓华以Read，Anderson，1/4MS，1/10MS对亮毛杜鹃进行比较实验，发现在Read，Anderson，1/4MS培养基上7d后完全褐化死亡，培养在1/10MS上的植株21 d后死亡。
2003年，王荃等[23]研究东洋杜鹃花R. obtussum的合适的组织培养各因素条件。结果表明，由于杜鹃花科植物原产于高山酸性土壤，低盐分浓度及高比值NH4+/NO3-的基本培养基K和B适合东洋杜鹃。
目前为止，培养杜鹃广泛选用MS，Anderson的改良MS，1/4MS、Anderson和Read这5种培养基。这5种培养基在许多方面存在差异，但主要的区别在于总盐含量和铵态氮与硝态氮的比值。选用何种培养基，因杜鹃的种、品种及外植体而异，需要实验来确定。
4 植物激素的选用
因培养的杜鹃种和品种差异激素的效果是不同的，因此在培养中应当仔细观察比较，选定适宜的细胞分裂素。
6-BA和ZT在杜鹃组培中应用较多。1975年Anderson培养高山杜鹃的实验表明6-BA有害于杜鹃的生长增殖。1981年，培养几个杜鹃种和杂种R.cauescens， R.ChopTank， R.prounifolium， R.prounifolium×arbrescens时，发现6-BA不但抑制侧芽萌发，也抑制增殖，而采用2iP时，有两个种6周内可增值3～4倍。2001年钟宇用ZT培养西洋杜鹃R. hybridn。2003年孙振元等用ZT培养基培养毛白杜鹃R. mucronatum，获得成功。2003年李俊强(四川农业大学硕士学位论文，2003)用6-BA培养银叶杜鹃R. argyrophyllum。顾地周等进行牛皮杜鹃R. chrysanthum组织培养与快速繁殖的研究时，用6-BA作为愈伤诱导和分化的激素，取得成功。陈新平在R. simsii组织培养时发现细胞分裂素以ZT的诱芽效应较为显著。2003年王亦菲等以西洋杜鹃的两个栽培品种R. britannia，R. america为材料探讨外源激素种类对杜鹃繁殖系数的影响，结果在ZT与NAA组合上获得了较高的繁殖系数。2003年王荃等研究东洋杜鹃花R. obtussum的合适的组织培养各因素条件，结果表明，6-BA适合东洋杜鹃。2004年，苗永美在用6-BA、KT并附加一定的生长素培养大树杜鹃R.protistum时，发现叶片逐渐变黄死亡，最后导致材料的整体死亡，因此，认为6-BA、KT至少其中的一种对大树杜鹃有毒害作用。2004年，闫凤霞等进行R. simsii的快繁生产时，选取6-BA为细胞分裂素，取得较好效果。2003年梁晓华等对亮毛杜鹃R. microphyton的研究得出的结果是ZT比较适合亮毛杜鹃生长。
TDZ也被广泛应用于杜鹃的离体培养。苗永美用TDZ诱导R. Simsii的叶片产生丛芽，但芽极短(四川农业大学硕士学位论文，2004)。在苗永美的3种杜鹃的叶片培养研究中，TDZ不仅诱导3种杜鹃叶片产生了愈伤组织，而且TDZ还诱导桃叶杜鹃和银叶杜鹃叶片直接产生不定芽。李俊强用6-BA诱导银叶杜鹃叶片产生了愈伤组织，发现愈伤组织不能在含有6-BA的培养基上存活，最后逐渐死亡，而在苗永美研究中发现，TDZ能很好地维持银叶杜鹃愈伤组织的生长，且发生了再分化诱导出了不定芽，说明TDZ在使银叶杜鹃叶片脱分化和再分化方面要强于6-BA;同样用6-BA也没有从银叶杜鹃叶片诱导出不定芽，说明TDZ具有比6-BA更高的使培养物直接分化芽的能力。2008年，程雪梅在马缨杜鹃R. delavayi的组织培养中首先利用TDZ诱导从生芽，然后转入含KT 的培养基使丛生芽伸长，取得较好效果。苗永美用Anderson的改良MS +TDZ + IBA(NAA)杜鹃R. spp的茎段、茎尖，1个月产生了大量丛生芽;而用6-BA、KT时，只出现腋芽萌发，顶芽伸长，无丛生芽产生。由此看来，TDZ对诱导丛生芽很有效，但不会使芽伸长。
杜鹃组培苗成本较高 ，降低组培苗成本，是工厂化生产杜鹃组培苗的迫切需要。在细胞分裂素的选择上，ZT和TDZ都有成功的范例，但是ZT的价格较高，所以采用TDZ更好。
5 根的诱导
杜鹃生根并不困难，当把杜鹃的茎尖培养在无细胞分裂素的培养基上，将停止增殖，并且90%的茎尖会在插入培养基的部分长出不分枝的根。
国内大多使用IBA，NAA，IAA等生长素来诱导生根。钟宇使用IBA生根效果优于NAA，用NAA处理的嫩枝先在茎的基部生成较多的愈伤组织，甚至接触培养基的叶片也长有大量愈伤组织，稍后从愈伤组织上长出根，数量极多，但细短，而采用IBA诱导根的小苗，根部愈伤组织少，根较壮，但数量少。以IBA、NAA共同作用的Read+NAA 2.0mg/L+IBA 2.0mg/L对R. hybridn生根效果最好。王亦菲的实验表明，西洋杜鹃在不含激素的1/2Read(仅大量元素减半)培养基上有22%的生根率;在1/2 Read + IBA 1.0 mg/L的培养基上生根最好，达84%;而在NAA的培养基上虽有生根，但来自愈伤组织，易脱落，效果不好。秦静远采用WPM +IAA 1.75mg/L+活性炭0.25%生根效果较好。杜鹃组培苗生根数量随继代次数而增加，直到第4代达到最高，以后保持平稳，故应以第4代以后培养的枝条进行生根培养最好，均可达到100%的生根率。也有人使用Anderson或1/2 Anderson，1/3Anderson + IAA 1.0 mg/L+活性炭
2004年，毛元荣等[24]从活性炭、培养基pH值、培养条件、碳源等方面讨论了影响高山杜鹃R. delavayi生根的因素，结果表明活性炭有利于根的正常生长与发育;无琼脂的液体培养基生根明显快于固体培养基;培养基的pH值5.0～5.5最适合杜鹃生根;蔗糖浓度对生根率无影响，但影响小苗根的生长速率。2006年，苗永美对桃叶杜鹃组织培养技术研究时发现两种生长素(IBA,NAA)和AC是生根的主要因子。
国内对于杜鹃的培养大多采用瓶内生根，而国外大多采用瓶外生根，瓶外生根所使用的生长素与瓶内一致。瓶外生根的主要方法是;将芽的基部在生长素中浸泡，然后栽到泥炭∶珍珠岩=2∶1(V∶V)的花盆中，放到条件适宜的环境中;或者将芽的基部在生长素中浸泡后，放到培养基中预培养1周，然后栽到泥炭∶珍珠岩=2∶1(V∶V)的花盆中，放到条件适宜的环境中。近年来，国内也开始采用瓶外生根。2006年，朱春艳等将云锦杜鹃组培苗扦插在无土基质中,达到85%以上的瓶外生根率。
瓶外生根具有相当大的优越性，它能显著降低组织培养的成本，简化组织培养的工序，在炼苗移栽上有相当大的优势，即炼苗移栽存活率高且操作简单，但瓶外生根技术步骤有待完善。
6 其他因素对杜鹃组培的影响
暗培养能显著降低培养材料的褐变率，其原因可能是光刺激酚类、质体醌、类黄酮等多种次生代谢物质的合成，酚类物质对外植体具有伤害作用而暗处理可抑制这些物质的合成[16]。
杜鹃喜欢酸性环境，pH值控制在5.0～5.4效果较好，超过6.0将严重影响杜鹃的增殖、生根及愈伤组织的形成。
在培养基中加入抗氧化剂，如维生素C、聚乙烯毗咯烷酮等，并且在接种之前用抗氧化剂浸泡外植体1～5 min，可显著减轻外植体材料褐变。在有些植物的组织培养中，吸附剂的添加有抑制褐变的作用，其原因可能是吸附剂有效地吸附了外植体上多酚氧化酶氧化酚类物质所产生的醌类物质[15]，减轻了醌类物质对外植体的伤害。
一般在接种后1～2 h后，在三角瓶内将接种位置移动1次，也可减轻外植体的褐变。还有研究表明[15]在启动培养初期，即接种后的3 d内每天在三角瓶内将茎尖转移位置，前4周每周转接一次，以后每4周转接1次，可有效减轻外植体的褐变。
7 存在问题
通过对杜鹃花组培近几十年的研究，已经初步建立了一套杜鹃组织培养的快繁体系，但是杜鹃花种和品种间的差别、茎叶等外植体的消毒、不定芽分化率低、优良品种生根困难、完整植株的移栽体系等问题，仍是杜鹃花组织培养中急需研究和解决的根本问题。
【参考文献】
[1] Anderson W.C .Propagation of Rhododendrons by Tissue Culture: Part I. Development of a Culture Medium for Multiplication of Shoots[J]. Proc. Intl. Plant Prop. Soc,1975,25:129.
[2] 宗宪春.二种杜鹃花的快速繁殖研究[J].牡丹江师范学院学报,1999,1:5.
[3] 钟 宇,张 健，罗承德，等. 西洋杜鹃组织培养技术体系研究[J].四川农业大学学报, 2001,19(1):37.
[4] 王亦菲,孙月芳,周润梅,等.两种西洋杜鹃的组织培养[J].上海农业大学学报, 2003,19(2):9.
[5] 梁晓华,李晓刚.亮毛杜鹃组织培养技术研究初探[J].楚雄师范学院学报, 2003,18(3)：65.
[6] 闫凤霞,胡金萍,徐立明. 杜鹃花的组培繁殖[J]. 国土与自然资源研究,2004，1:94.
[7] Meyer, M. M., Jr.. In vitro propagation of Rhododendron catawbiense from flower buds[J]. Hortseience, 1982,17：891.
[8] 邱 璐,梁晓华,黄 静,等.杜鹃组织培养研究进展[J].安徽农业科学,2005,33(9):1717.
[9] 秦静远,黄玉敏.杜鹃的组织培养及快速繁殖[J].植物生理学通讯,2003,39(1):38.
[10] 邓百万,陈文强.比利时杜鹃的组织培养的研究[J].氨基酸和生物资源,2002,24(3) :25.
[11] 汤桂钧, 张建安, 蒋建平, 等.高山杜鹃的组织培养快速繁殖技术研究[J].上海农业学报, 2004,20(3): 15.
[12] 朱春艳,李志炎,鲍淳松,等.云锦杜鹃组培快繁技术研究[J].中国农学通报, 2006, 5(5):335.
[13] 罗 彭,庄 平,白 洁.大白杜鹃、美容杜鹃和喇叭杜鹃的组织培养[J].植物生理学通讯, 2007,43(2):1.
[14] 程雪梅,赵明旭,何承忠,等.马缨杜鹃的组织培养与快速繁殖[J].植物生理学通讯,2008,4(2):297.
[15] 李浚明.植物组织培养教程[M].北京:北京农业大学出版社，1992：179.
[16] Boxu,P.H.，Tri,J-M. Control of accidental contamination during mass propagation[J]. Acta Hurticultura,1988,225:189.
[17] 陈新平, 何小弟, 黄永高, 等. 杜鹃花组织培养技术研究[J].江苏林业科技, 2003,10(3):10.
[18] 黄萍萍. 高山杜鹃(蒙他瑰) 快速繁殖技术研究[J]. 福建农业科技, 2004, 3:23.
[19] 官汝淳, 姜天云, 顾地周, 等. 短果杜鹃的组织培养与快速繁殖[J].植物生物学通讯, 2008,44(1):133.
[20] 孙振元,徐文忠,刘淑兰,等.毛白杜鹃耐碱突变体的离体筛选与鉴定[J].中南林学院学报, 2003, 10(5):53.
[21] 顾地周, 丛小力, 姜海智, 等. 牛皮杜鹃的组织培养与快速繁殖[J].植物学通讯, 2008, 44(2):300.
[22] 周 艳,陈 训.马缨杜鹃继代培养培养基配方研究[J].安徽农业科学,2007,35(29):9213.
[23] 王 荃,胡宝忠.杜鹃花组织培养技术研究[J].东北农业大学学报,2003,34(4):368.
[24] 毛元荣,路 群,汤 敏,等. 影响高山杜鹃生根的几个因素[J].曲阜师范大学学报, 2004, 1:88.
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