临床微生物实验室细菌鉴定指南（下）

五．奈瑟氏菌属和布兰汉菌属

奈瑟氏菌属主要有脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌；布兰汉氏菌属只有卡他布兰汉氏菌。两者系需氧革兰阴性球菌。

⑴     奈瑟氏菌的生物学特性：革兰阴性球菌，需氧，卵圆形或肾形，无动力，氧化酶及触酶均阳性。培养时对营养要求高，能在巧克力平板或有丰富营养的血平板上，在5～10%CO₂环境中生长。

⑵．鉴定过程：

a． DNA酶实验阳性为布兰汉氏菌，阴性则为奈瑟氏菌。

b． 能在普通血平板上生长的为其他奈瑟氏菌，在巧克力平板上生长的主要为脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌。

c． 能使麦芽糖氧化分解产酸的是脑膜炎奈瑟氏菌，不利用麦芽糖的是淋病奈瑟氏菌。

      ⑶．几种主要细菌对葡萄糖﹑麦芽糖﹑蔗糖的氧化分解产酸结果如下：

                                氧化分解产酸

⑷     DNA酶实验：

a． 方法：将待鉴定细菌点种于含0.2%DNA的DNA琼脂平板上，培养后用1mmol/LHCl覆盖平板，菌落周围出现透明环者为阳性。

b． 原理：某些细菌能产生DNA酶，可使DNA长链水解成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸链；长链DNA可被酸沉淀，而水解后形成后的寡核苷酸链则可溶于酸，故在DNA琼脂平板加盐酸，可在菌落周围形成透明的溶血环。（肠杆菌科中只有沙雷氏菌和变形杆菌可产生DNA酶，阳性球菌中只有金葡菌能产生DNA酶。）

   六．肠杆菌科

肠杆菌科是一大群生物学性状相似的革兰阴性杆菌，其中对人致病性较强的鼠疫耶尔森菌（现已基本没有流行）和伤寒沙门菌；4类常引起腹泻和肠道感染的细菌（埃希氏菌﹑志贺氏菌﹑沙门氏菌﹑耶尔森氏菌）和8种常导致院内感染的细菌（枸橼酸杆菌属﹑克雷伯菌属﹑肠杆菌属﹑多源菌属﹑沙雷菌属﹑变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属）。另外还有很多细菌是肠道的正常菌群，但在一定条件下也可致病（条件致病菌）。

实验过程中对于革兰阴性杆菌首先要做氧化酶实验，阴性为肠杆菌科细菌；阳性的为非发酵菌（我们实验室还没有简单的系统鉴定方法，一般要仪器上卡检测）或弧菌科细菌。

1． 肠杆菌科的系统生化

⑴．KIA试验（克氏双糖铁）

组成：乳糖／葡萄糖=10／1（斜面／高层，其长度最好是都是2CM）

结果判断：斜面或高层变黄色：阳性；不变色（红色）：阴性

          高层中出现裂隙：产气阳性

          高层中出现黑色（FeS）：产H₂S阳性

⑵．苯丙氨酸脱羧酶试验

细菌产生的苯丙氨酸脱羧酶使苯丙氨酸氧化脱羧后生成苯丙酮酸，再与10%的FeCl₃试剂产成深绿色反应。（变形杆菌属﹑普罗威登菌属和摩根菌属为阳性，其他为阴性）

⑶．枸橼酸盐试验（碳源利用实验）

在枸橼酸盐培养基中细菌能利用的碳源只有枸橼酸盐，分解后生成碳酸钠，使培养基变碱性，pH指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿色变为深兰色，即为枸橼酸盐试验阳性。（埃希氏菌属，志贺氏菌属，爱德华菌属为阴性，其他为阳性）

注意：接种时不能被糖，蛋白胨污染，要单独接种）

⑷．甲基红（MR）试验

细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸等，使培养基的pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂由桔黄色变桔红色为弱阳性；变红色为阳性。

培养基成分：葡萄糖蛋白胨水

试剂：甲基红0.1g，酒精300ml，水200ml

主要用于大肠埃希菌（＋）和产气肠杆菌（－）的鉴别；常与V-P实验联合使用，一般情况下两者结果正好相反，但也有例外如奇变两者同为阳性。

⑸．MIU（动力－靛基质－尿素）试验

①．动力：在半固体培养基中穿刺接种细菌培养后，若穿刺线周围有细菌扩散生长，则为动力（＋）；清晰则为动力（－）。

②．靛基质试验（吲哚试验）：某些细菌有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸生成吲哚。吲哚再与试剂对位二氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而呈红色。

③．尿素试验：某些细菌能产生尿素酶，分解尿素产生大量的氨，使培养基变碱，再使培养基中的指示剂（0.4%酚红）变红色即为阳性。

         ⑹．硝酸盐还原试验

NO₃ˉ→→NO₂ˉ（大肠）

NO₃ˉ→→NH₄^＋

NO₃ˉ→→N₂（沙雷氏菌属）

试剂甲：对氨基苯磺酸

试剂乙：α-萘胺

观察结果时甲液和乙液要等量加入，立即或10min内出现红色为阳性。若不变色，则要加入锌粉：①变红色，说明硝还试验为真阴性②仍不变色，说明硝还试验真阳性，但原先还原产物不是NO₂ˉ。

阴性结果出现时有三种可能：①细菌不能还原硝酸盐②亚硝酸盐继续分解生成氨或氮③培养基不适合细菌生长

肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐。

         ⑺．氨基酸脱羧试验

            细菌产生脱羧酶分解氨基酸使其脱羧生成胺和CO₂，虽然各种细菌所产生的脱羧酶不一定相同，但最后都能生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和CO₂。然后胺能使培养基变碱性，通过指示剂（溴甲酚紫）由黄变紫即为阳性。对照管（无氨基酸）为黄色。

            注意：①微量管接种好后要加石蜡，使培养基造成厌氧环境。（生成的胺更稳定，还能诱导氨基酸脱羧酶的产生）

                 ②对照管如果不显黄色，则结果不能判断。

           应用：除伤寒沙门氏菌，鸡沙门氏菌外，其他沙门氏菌鸟AA，赖AA均为阳性；除宋氏和鲍氏志贺菌外其他志贺菌也菌为阳性。

          ⑻．葡萄糖酸盐试验

             微量管在培养18～24h后，加班氏试剂，水浴煮沸10min，由兰色变黄绿色到砖红色即为阳性，不变为阴性。

1． 肠杆菌的鉴定流程

⑴．根据苯丙氨酸脱羧酶实验：

   （＋）：变形杆菌属，普罗威登斯菌属，摩根氏菌属

   （－）：埃希氏菌属，志贺氏菌属，沙门氏菌属，枸橼酸杆菌属，爱德华菌属；克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属。

⑵．苯丙氨酸脱羧酶实验阴性，加做葡萄糖酸盐实验

（＋）：克雷伯菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，哈夫尼亚菌属

a． 动力（－）：克雷伯菌属，属内种的鉴定主要根据吲哚试验（肺克吲哚实验阴性，三个亚种鉴别试验IMViC：肺炎－－＋＋，臭鼻－＋－d，鼻硬结－＋－－）

b． 动力（＋），DNA酶（＋）：沙雷氏菌属

动力（＋），DNA酶（－），枸橼酸盐（＋）：肠杆菌属（主要是阴沟肠杆菌和产气肠杆菌，前者赖氨酸阴性，而后中为阳性）

动力（＋），DNA酶（－），枸橼酸盐（－）：哈夫尼亚菌属

（－）：加做IMViC（靛基质-甲基红-VP-枸橼酸盐）试验

a． IMViC（＋＋－－）：大肠埃希菌（H₂S－）或爱德华菌属（H₂S＋）。

b． IMViC（^－／_＋＋－＋）：枸橼酸杆菌属

⑶．苯丙氨酸脱羧酶实验阳性，根据产H₂S可分

（＋）：变形杆菌属

                 属内主要鉴定试验如下

（－）：普罗威登氏菌属，摩根氏菌属

       普罗威登氏菌属：鸟氨酸：－；枸橼酸盐：＋（属内鉴定尿素酶及一些碳水化合物的产酸试验，如甘露醇﹑阿拉伯糖﹑海藻糖等）

       摩根氏菌属：鸟氨酸：＋；枸橼酸盐：－（只有一个种：摩氏摩根氏菌）

⑷．志贺氏菌属和沙门氏菌属

这两种菌属在肠道选择性培养基（SS、麦康凯）形成不发酵乳糖的透明或半透明的无色菌落，但一些沙门氏能产H₂S就会形成中心黑色的菌落，鉴定时在选择性培养基上挑选可疑菌落进行鉴定。

a．志贺氏菌属

   主要系统生化：KIA：K/A（只有福氏6型能产气），H₂S（－）；MIU：－+/-－；

   苯丙：－；枸橼酸盐：－。

   报告结果时要根据其血清学的结果鉴定到种，即A群（痢疾志贺氏菌）﹑B群（福氏志贺氏菌）﹑C群（鲍氏志贺氏菌）﹑D群（宋氏志贺氏菌）；我国主要以B群和D群为主。

b．沙门氏菌属

   主要系统生化：KIA：K/AG，H₂S（+/－）；MIU：＋－－；苯丙：－；枸橼酸盐：－。

  伤寒沙门氏菌的抗原结构：菌体抗原（O抗原），鞭毛抗原（H抗原），包膜抗原（主要是Vi抗原）

 根据系统生化鉴定到沙门氏菌属后，在根据其抗原结构的特点，用血清学凝集分到种即可报告结果。

血清凝集步骤如下：

A-F多价O（＋）：

 O₂，Ha（＋）：A群（甲型副伤寒沙门氏菌）

 O₄，Hb（＋）：B群（乙型副伤寒沙门氏菌）

 O_6﹑7，Hc，Vi（＋）：C群（丙型副伤寒沙门氏菌）

 O₉，Hd，Vi（＋）：D群（伤寒沙门氏菌）

 O_3﹑10，Heh（＋）：E群

 O₁₁，Hi（＋）：F群

A-F多价O（－），做Vi血清因子凝集：（＋）浓菌液沸水煮沸30min，再用A-F多价O血清定群；（－）继续以A-F以外的多价O血清凝集分型。

血清凝集注意：确定O群后， 一定要用H因子再做凝集；最终结果要以凝到H相后才能报告。

  七．非发酵革兰阴性杆菌

非发酵革兰阴性杆菌是指一群不利用葡萄糖或仅以氧化形式利用葡萄糖﹑需氧或兼性厌氧﹑无芽胞的革兰阴性杆菌。氧化酶试验一般阳性，除不动杆菌属和嗜麦芽假单胞菌外。

非发酵菌按下列试验进行初步分属

下面主要讲一下铜绿假单胞菌：在血平板上形成的菌落大而扁平﹑湿润﹑有金属光泽，有生姜味的灰绿色或兰绿色的菌落，并有明显的溶血环。常有色素产生（绿脓素，青脓素，红脓素，黑脓素等），在MH平板上更加明显。

铜绿假单胞菌的最低鉴定标准：①动力＋②氧化酶＋③枸橼酸盐＋④氧化分解GLU，木糖⑤不利用麦芽糖⑥赖﹑鸟氨酸脱羧酶试验－⑦精氨酸双水解酶试验＋⑧H₂S－。

八．棒状杆菌属

          棒状杆菌属是一群革兰阳性杆菌。菌体大小长短不一，常一端或两端膨大呈棍棒状。

          大多数存在于水和土壤中，其中有的是人和动物粘膜上的正常菌群，若是从无菌部位分离到棒状杆菌，应予以鉴定（如宫颈拭子）。

          在血平板上能生长，但生长不良好，菌落细小，湿润。

      鉴定：根据触酶和有无溶血，可分：

           ⑴．H₂O₂＋，无溶血：白喉﹑假白喉﹑溃疡﹑干燥﹑假结核﹑马棒﹑牛棒

           ⑵．H₂O₂－，有溶血：溶血棒﹑化脓棒﹑阴道棒

           ⑶．加做葡萄糖，麦芽糖，蔗糖产酸试验，结合⑴⑵和标本类型，基本上可以鉴定到是哪一种棒状杆菌。

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