基层兽医如何进行药敏试验

　　 一、试验步骤

　　 1.试验材料：

　　 1.1普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

　　 1.2药敏试纸：购买或自制。

　　1.3细菌：待做药敏试验的细菌。

　　 1.4接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯。

　　 1.5移液器、滴头。

　　 2.试验准备：

　　 2.1药敏片的准备：购买或自制。

　　 2.1.1药敏片的制备：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅高压、15-20分钟消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

　　 2.2.2抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。

　　 2.2药液的制备(用于商品药的试验)：按商品药使用治疗量的比例配制药液；如商品药“百病消”按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

　　 3.试验操作方法：

　　 3.1药敏片法

　　 3.1.1在“超净台”中，用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。(另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面，涂布均匀致密)。

　　 3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片(外周一般可贴七片)，每种药敏片的名称要记住。

　　 3.1.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

　　 3.2牛津杯法

　　 3.2.1在“超净台”中，用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。(另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密。)

　　 3.2.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(内径6mm、外径8mm、高10mm圆形小管，管两端光滑，也可用玻璃管、瓷管)，放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。几分钟后，向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。在37℃下培养8-18小时，观察结果。

　　 3.2.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

　　 3.3打孔法：该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

　　 3.3.1在“超净台”中，用经(酒精灯)火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。(另可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面，涂布均匀致密。)

　　 3.3.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管)，放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏，影响结果)。

　　 3.3.3加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。

　　 3.3.4将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

　　 二、结果观察：

　　 过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

　　 三、判定标准：

　　 1.药敏试验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

　　 表1（药物敏感试验判定标准）

　　 2.药物敏感试验判定标准参考

　　 在9毫米以上为敏感，6-9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

　　 四、影响药敏结果的因素

　　 1.培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度约5-6mm，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质。

　　 2.细菌接种量：细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

　　 3.药物浓度：药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

　　 4.培养时间：一般培养温度和时间为37℃、8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

　　 五、应用

　　 药物敏感试验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。

　　 在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果

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