培养基影响大肠杆菌产L-天冬酰胺酶的研究

关键词：培养基；L一天冬酰胺酶；大肠杆菌 

 研究发现，L—天冬酰胺是某些癌细胞生长的营养源，但癌细胞自身不能合成L ． 天冬酰胺，因此L一天冬酰胺酶通过对L天冬酰胺的水解作用能有效抑制癌细胞的生长^［1～2］。临床试验证明，L一天冬酰胺酶尤其对急 性白血病和恶性淋 巴母细胞肿瘤有效^［3-4］。近年来由于其应用范围的不断扩大，采用大肠杆菌发酵生产L ．天冬酰氨酶受到很多学者的重视，培养基的选择对于上述问题的研究仍具有重要意义，因此本文从培养基成分和添加比例两方面对这一问题加以讨论。

1 材料与方法  

1、1  菌株

大肠杆菌 ( E．coli  )，由本教研室生物工程中心实验室提供。

1 、2 培养基

菌种采用基本培养基进行斜面移种和保藏。发酵培养基按照不同影响因素配制。

1、3 培养条件

在250 mL三角瓶中进行摇瓶培养，装液量50 mL，摇床转速300 r／min，培养温度37℃，发酵时间l6～20h。   

1、4 测定方法

L一天冬酰胺酶活性测定参Nessler 试剂法^［5］。 37℃下，1  min催化L一天冬酰胺水解生成1grnol 氨的酶量为一个酶活力单位。再由生物量得出单位菌体的酶活，即比酶活力 ( U／g )。产氨率 (％)为单位菌体的产氨量。

菌体浓度测定采用分光光度法测定。试剂均为国产分析纯。

2 结果与讨论

2、1碳源对大肠杆菌产L．天冬酰胺酶的影响

2、1．1碳源种类对大肠杆菌产L．天冬酰胺酶的影响

     相同的培养条件下，分别选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、柠檬酸三钠、乳糖作为碳源，按1．0％的比例添加到液体基本培养基中，以基本培养基为对照，经发酵产酶后测定其生物量、产氨量和比酶活。

     以蔗糖为碳源时，其比酶活最高，约为322 U／g，产氨量约为2．45ug／mL，生物量较为适中。与对照实验相比，除了葡萄糖和柠檬酸三钠作为碳源时所得比酶活减弱外，其他都有所提高分析原因可能是柠檬酸三钠一般作为某种特定菌种的碳源，生物量增加较多但比酶活不高，因而不是该菌株产酶最适宜的碳源；葡萄糖作为碳源抑制产酶可能与葡萄糖效应有关，葡萄糖的添加不仅改变了培养基的渗透压使水活度减小，最主要的是葡萄糖的代谢致使发酵后期大量有机酸的积累，降低了pH从而产酶明显受到抑制。

2.1.2          碳源添加量对大肠杆菌产L-天冬酰胺酶的影响

蔗糖为碳源时，其酶活力最大，但是蔗糖的添加量也会影响到该菌株的产酶能力。据此分别按0.3%、0.5%、0.7%、1%以及1.5%的比例添加蔗糖作为碳源，在其它相同的条件下进行试验，测定相应的比酶活和产氨率

在0.3%-0.7%范围内，随着蔗糖添加量增大，其比酶活也相应地增大，最大值达到332.5U/g。当添加量继续增大时，其比酶活减小。产氨率也具有相似的趋势。故选取蔗糖的添加量为0.7%作为碳源的添加比例。

2．2 氮源对大肠杆菌产L一天冬酰胺酶的影响

2．2．1 氮源种类对大肠杆菌产L一天冬酰胺酶的影响以基本培养基中添加量1．0％的蛋白胨为固定氮源，然后分别以添加量0．3％的牛肉膏和酵母膏作为辅助氮源进行比较，以添加量0．7％的蔗糖为碳源，其余的条件相同进行实验，测定其相应的参数。结果如表1所示

表1辅助氮源种类对大肠杆菌产L一天冬酰胺酶的影响

Tab．1Effect of adding amount of nitrogen source on the yield of L- asparaginase  

由表 l可看出选择0．3％牛肉膏+ 1．0％蛋白胨作为该菌株的氮源时，其比酶活为 3l0．86U/g，相对于0．3％ 酵母膏+1．0％蛋白胨作为氮源比酶活提高了约9．4 ％。 分析原因可能是在同等条件之下，牛肉膏中所含有的某些特殊成分比酵母膏更适于菌体的生长，从而为菌体细胞积累L一天冬酰胺酶提供更加丰富的氮源。 

2、2．2 氮源添加量对大肠杆菌产 L 一 天冬酰胺酶的影响

      辅助氮源添加量的大小也会影响到菌株的产酶能力。在其它相同的条件下蛋白胨的添加量不变仍为l％， 改变牛肉膏的添加量，分别为0．2％、 0．3％、 0．4 ％、0．5％、0．6％、0．8％以及 l ％进行实验。

     由图3看出，当牛肉膏添加量为0．5％时，该菌株所产L一天冬酰胺酶的比酶活力最高达到345．68U／g，产氨率也达到最高5．12％。因而培养该菌株时选择0．5％牛肉膏+1．0％蛋白胨作为最适宜的氮源。 

2、3 微量元素对大肠杆菌产L -天冬酰胺酶的影响

2、3．1微量元素种类对大肠杆菌产L一天冬酰胺酶的影响

按添加量均为0．05％分别选用硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌以及碳酸钙等微量元素添加到培养基中进行实验，以不添加微量元素作为对照。其它实验条件相同，

从图4中可以看出，添加0．05％的硫酸铜和硫酸锌对大肠杆菌产L．天冬酰胺酶都会有一定的抑制作用，碳酸钙的加入基本无影响，而硫酸亚铁的添加对大肠杆菌L．天冬酰胺的产生有促进作用，比酶活最高为 341．92 U／g，相对于对照提高了17．6％。原因在于铁是微生物细胞内过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素与细胞氧化酶的组成元素，缺铁会使机体内的某些代谢活性降低或丧失。大肠杆菌在铁含量不足的培养基里培养时，不能合成足够的甲酸脱氢酶，而使其生长和代谢受到影响。铜和锌两种微量元素抑制了酶活，原因可能是作为诱导酶的抑制剂，使得产酶受阻。

2、3．2 硫酸亚铁添加量对大肠杆菌产 L．天冬酰胺酶的影响  

按照上述实验结论，以硫酸亚铁作为微量元素， 添加量分别为0．005％、0．01％、 0．0 2％、0．03％、0．04％、 0．05％，以不添加硫酸亚铁作为对照，在摇床上进行发酵，取样测定相应参数.