不同培养基对肠毒素大肠杆菌疫苗株产生菌毛的影响

【 摘要 】  目的通过比较不同培养基对疫苗株产生菌毛的影响，获得一种有利于细菌生长和菌毛产生，而且费用低廉的培养基。方法 通过测定培养物的密度，观察疫苗菌株的生长规律，用斑点ELIS A和全菌ELISA检测菌毛抗原的表达情况。结果LB培养基既有利于疫苗株的生长，又有利于细菌菌毛的表达。结论 LB培养基可以用于疫苗株中试和大规模培养。 

【关键词 】 肠毒素大肠杆菌；疫苗株；培养基；斑点ELISA；菌毛

近些年来，肠毒素大肠杆菌( ETEC )疫苗候选株的研制主要是针对激发抗定居因子菌毛的肠道抗体和中和热敏肠毒素的抗毒素，包括灭活的产菌毛的ETEC和纯化的菌毛。由于死菌苗保护时间较短，以减毒的痢疾菌和沙门氏菌等为载体的ETEC疫苗应运而生。 

本文以志贺氏痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32的asd(天冬氨酸-β-半醛脱氢酶)基因突变株为载体宿主，运用宿主/质粒平衡致死系统，构建了表达ETEC菌毛抗原和肠毒素抗原的活菌口服疫苗候选株。动物实验结果表明，疫苗候选株具有良好的免疫应答反应。本研究的目的是寻找一种既适宜于疫苗株生长，又有利于菌毛表达的廉价培养基，为疫苗的大规模生产奠定基础。 

材料与方法

1．菌株

产生ETEC   CFA1／CS6菌毛的疫苗候选株FE16以及产生ETEC  CS3菌毛和肠毒素融合蛋白的疫苗候选株FE3；志贺氏痢疾杆菌福氏2a疫苗株T32的asd(天冬氨酸-β-半醛脱氢酶)基因突变株 FWL01。

2．培养基

CFA培养基(水解酪蛋白10g／L，酵母粉1．5 g／L ， MgSO₄·7H₂O  0.05 g／L，MnCl₂  0.005g／L。调pH至7.4 )；LB培养基(酵母提取物5g／L，胰蛋白胨10g／L，NaCl  10g／L，调pH至7.4 )；进口TS培养基(Tryptone  15g/ L，Soytone 5g/L，NaCl 9g／L，pH 7.4 )和国产TS培养基(胰蛋白胨15g／L，大豆蛋白胨5g／L，NaCl  10g／L，pH 7.4 )。水解酪蛋白为DIFCO产品；酵母粉和酵母提取物为OXOID产品；胰蛋白胨和大豆蛋白胨为北京双旋微生物培养基制品厂产品。 

3．抗体

抗CS3单克隆抗体由瑞典Gobebourgs大学Svennerhom教授惠赠；CFA多克隆抗体系本研究室制备；辣根过氧化酶标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG购自Sigma公司。 

4．细菌培养

将疫苗候选株FE3或FE16  37℃过夜(16～18h)的培养物，按1％的接种量接种于含有100ml培养基的三角瓶内，在37℃下震荡(190～200r/min)培养，每2h取样测定A₆₀₀，直至12h达到对数生长期 为止。 

5．斑点 ELISA 

每2h取的样品，分别取5μl进行倍比稀释，逐次点在0.45μm硝酸纤维素膜上。用含2％牛血清白蛋白和0.05％Tween20的PBS封闭，室温30min。用PBST(PBS-0.05％Tween20)缓冲液洗1次，置于用封闭液稀释的抗体中(抗CS3为单克隆抗体，1：3000稀释，抗CFAI 多克隆抗体1：1000稀释)，室温作用1 h。用PBST缓冲液洗5次。再置于用封闭液适当稀释的羊抗鼠HRP-IgG(针对抗CS3单克隆抗体)或羊抗兔HRP-IgG(针对抗CFA/1多克隆抗体) 中，室温作用30min。用PBST缓冲液洗5次。最后，加入酶底物溶液(0.05％Tris—HCl，pH7.4，  0.5mol／L  NaC1，0.06％二氨基联苯胺，0.2％H₂O₂)显色。待显色适度后，用2mol/ L  H₂SO₄  终止反应，水漂洗后阴干并观察结果。 

6 ． 全菌 ELISA 

将上述不同培养时间取样的细菌培养物，于8000r/min  4℃离心5min， 然后用包被液( NaHCO₃  2.93g/L，Na₂CO₃ 1.95g/L，pH9.6)悬浮菌体并调整菌悬液的浊度均为A=1.0。用菌悬液包被酶联板，100μ/孔，于4℃包被过夜。用PBST(PBS缓冲液加 0.05％Tween 20)洗涤3次。每孔加入200μ/L 3％封闭液( PBS缓冲液加3％牛血清白蛋白和0.05％Tween20)， 放置37℃保温1h。用PBST洗3次，每孔加入100μl适当稀释的抗CS3的单克隆抗体或抗 CFA/1多克隆抗体，置37℃保温1h。用PBST洗涤3次，每孔加入100μl适当稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG，置37℃保温1h。用PBST洗涤3次，每孔加入100μl底物显色液(磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液[NaHPO₄  0.05mol／L，柠檬酸0.24mol／L， pH 5.0 ] 10ml 加邻苯二胺 4mg和15μl  30％H₂O₂ ) 。待显色适度时，每孔加入50μl  2mol／L  H₂SO₄终止反应，并用酶联仪测定A₄₉₂值。 

结  果

1．疫苗候选株生长曲线

产肠毒素大肠杆菌基因工程疫苗FE16和FE3是以痢疾疫苗株FWL01 (T-32的asd基因插入灭活突变株)为宿主载体，分别克隆表达了产肠毒素大肠杆菌的CFA/1、CS6菌毛和CS3菌毛及两种肠毒素融合抗原。为了研究重组菌株的生长规律，用LB培养基在37℃条件下振荡培养。尽管FE16和FE3表达了外源抗原蛋白，但其生长曲线与载体宿主 FWL01仍无显著差异 。 

2 ． 不同培养基对疫苗候选株生长的影响

比较了4种培养基对疫苗候选株FEl6和FE3的影响，FE3在不同培养基中的生长情况。FE16了生长稍微旺盛外，与FE3本相同(结果未列出)。经3次实验的结果表明，LB和CFA培养基较之TS培养基更适合疫苗候选株 FEl6和FE3的生长。 

3．不同培养基对疫苗候选株产生菌毛的影响

经斑点ELISA检测FE3疫苗株在不同培养基的CS3菌毛产生水平，结果以LB培养基最高。将FE3培养物稀释到A₆₀₀ =1.0，用ELASA检测3次结果均表明LB培养基有利于菌毛产生。 ( FEl6产生FA1的水平与上述结果基本接近) 。 

表 1  FE3疫苗株在不同培养基产生 CS3菌毛水平

讨  论

肠毒素大肠杆菌是造成发展中国家婴幼儿和旅游者细菌性腹泻最主要的致病菌之一。其菌体表面的菌毛抗原是首要保护性抗原。ETEC疫苗的研究已有近20年的历史，至今仍没有理想的疫苗用于人体。本研究构建的载体活菌疫苗，特点是免疫接种后靠重组菌在机体内繁殖产生保护性抗原，刺激机体产生特异性免疫性反应，同时活菌还起佐剂作用，是一种比较理想的疫苗类型。通过比较不同培养基对疫苗株产生菌毛的影响，发现实验室常用的成分 简单、费用低廉的LB培养基无论是在细菌生长密度还是在菌毛表达方面，都适合本课题研究开发的新型致腹泻性研EC载体疫苗的培养，为今后疫苗的中试及大规模生长奠定了良好基础。以往为了利于野生型研EC产生菌毛，一般采用CFA培养基。而本实验结果表明，LB培养基像CFA培养基一样，有利于以痢疾杆菌为载体宿主的肠毒素大肠杆菌菌毛的产生。 

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