阪崎肠杆菌生长特性及耐热耐酸碱性分析

摘 要：

目的 研究不同阪崎肠杆菌菌株的生长特性和耐热耐酸碱性。

方法 采用光谱扫描仪培养22株阪崎肠杆菌，由扫描仪实时监测不同阪崎肠杆菌菌株生长特性；采用显色平板涂布方法观察高温和酸碱条件下阪崎肠杆菌存活情况。

结果 传统平板计数法和微孔板光谱扫描仪建立的阪崎肠杆菌生长曲线具有良好相关性( R²=0.92 )；22株阪崎肠杆菌经75℃处理2 mi n后。尚有1株存活；经碱处理后( pH12.55 ) 立即检测，所有菌株均已死亡；用酸处理1 mi n后( pH1.18 ) 检测， 尚有2株存活。

结论 采用光谱扫描仪方法测定阪崎肠杆菌生长曲线方便快捷，不需要培养计数；不同的阪崎肠杆菌菌株具有不同的耐热、耐酸特性。 

阪崎肠杆菌(Enterobacter  sakazakii) 是一种有周生鞭毛、能运动、无芽孢、兼性厌氧的革兰阴性杆菌，以前称为黄色阴沟肠杆菌。食品中的阪崎肠杆菌污染受到全世界关注。目前关于阪崎肠杆菌生长特性、耐热耐酸碱性方面的观察方法及结果不尽一致。本文采用光谱扫描仪测定阪崎肠杆菌含量，研究阪崎肠杆菌生长特性与耐热耐酸碱性。

结果报告如下。 

l 材料与方法

1.1 材料    ( 1 ) 菌株：阪崎肠杆菌菌株22株[中国检验检疫 科学研究院下设的食品微生物菌种保藏库( IQCC ) ] ， 其中4 株为美国模式菌种收藏中心菌株，另外l 8株分离自不同食品 产品。( 2 ) 主要试剂： 阪崎肠杆菌显色底物( X—α—D—glu —copyranoside．北京路桥技术有限责任公司) ； 脑心浸液( BHI ) 培养液： 称取37gBHI 溶解于1000 ml水，高温煮沸溶解，高压锅121℃灭菌15 min，备用；脑心浸液培养基，称取18.5g  BHI 和9～12g琼脂， 0.04g 显色底物溶解于500 m l水， 高温溶解，高压锅121℃灭菌3min，备用。( 3 ) 主要仪器设备： 无菌操作台(美国Baker公司) ； 三洋IS600培养箱， 高压灭菌锅(日本三洋公司)； Labsysteml500光谱扫描仪(美国Thermo公司) 。 

1.2方法

1.2.1阪崎肠杆菌菌株生长曲线观察  采用光谱扫描仪测定阪崎肠杆菌含量。将阪崎肠杆菌菌悬液进行稀释至1 CFU／g 。吸取30μl菌悬液至96孔微孔板的每孔中，然后加入270μl 脑心浸液( 含有显色底物) 培养液。将96孔板放入扫描仪中，设定培养温度为37℃，测定波长为600min，测定时间间隔为0.5 h ，测定前振动10S，测定时间8h ；由扫描仪实时扫描自动生成阪崎肠杆菌8h内生长曲线。采用同一方法分别测定每株阪崎肠杆菌生长曲线，均重复测定3次。以300μl不含有阪崎肠杆菌的脑心浸液作为空白对照。采用平板计数法计数不同培养时间各试管中阪崎肠杆菌数量；以生长时间为横坐标，以阪崎肠杆菌数量的对数为纵坐标。 建立阪崎肠杆菌生长曲线。比较2种方法下阪崎肠杆菌生长变化情况。

1.2.2 阪崎肠杆菌热耐受性观察  按照说明书配制奶粉溶液，煮沸3次灭菌。吸取10ml奶粉溶液到灭菌试管中，分别置65，70，75℃水浴锅中，隔几分钟摇匀1次；3个温度条件下分别放置20, 3，2min。使奶粉溶液分别均匀达到65，70，75℃；然后各加入1μl阪崎肠杆菌，50min后取出，室温放置。待冷却至室温后，摇匀，吸取1ml 菌悬液至9ml脑心浸液培养液中过夜培养，观察培养液有否浑浊。如果未浑浊表明没有阪崎肠杆菌存活； 如果出现浑浊， 则吸取0.1m1 悬浊液涂布到显色培养基，3 7℃倒置培养过夜后，检查阪崎肠杆菌是否生长。

1.2.3阪崎肠杆菌菌株酸碱耐受性观察   吸取10 ml 奶粉1 溶液到灭菌试管中，分别加入1ml的HC1 溶液和8％的NaOH，使pH分别达到约1.18 ，12.55 。混匀后，加入1μl阪崎肠杆菌，立即或加入HC1 后静置1min，吸取1ml 菌液加入到9 ml 脑心浸液培养液中， 过夜培养复活。如果培养液未浑浊，表明没有阪崎肠杆菌存活；如果培养液浑浊。则吸取 0.1ml悬浊液涂布到显色培养基，37℃倒置培养过夜后， 检查阪崎肠杆菌是否生长。 

1.3 统计分析  采用Excel 表进行统计分析。 

2 结 果

2.1  2种方法监测阪崎肠杆菌生长曲线比较   ( R  =0.92 ， P<0.01) 。

在相同培养条件下，可以由A值计算阪崎肠杆菌数量，也可以由A值和培养时问建立生长曲线，不需要取样后涂平板进行培养计数。随着时间延长，阪崎肠杆菌数量迅速增加，处于对数生长期。但培养8h后，阪崎肠杆菌数量增加趋缓。 

2.2阪崎肠杆菌随时间生长特性 

采用光谱扫描仪测定7株分离自不同食品样品生化反应不同的阪崎肠杆菌生长情况； 以细菌达到稳定生长所需时间作为稳定生长时间( Ts ) ，用以衡量细菌生长的快慢。结果表 明，37℃培养时。不同阪崎肠杆菌菌株，其稳定生长时间( Ts )也不同，表明菌株生长快慢不同，但到培养末期时，其中几株生长较快的菌株数量差异无统计学意义 。 

2.3阪崎肠杆菌菌株的热耐受性  结果显示，22株阪崎肠杆菌65℃处理50min后，存活9株；70℃处理3min后，存活4株；75℃处理 2min后，存活1株。表明不同的阪崎肠杆菌菌株具有不同的热耐受性。 

2.4阪崎肠杆菌菌株的酸碱耐受性  结果显示，对22株阪崎肠杆菌进行碱处理后(pH 12.55 ) 立即检测，所有菌株均已死亡；用酸处理30s后( pH1.18 )检测，除1株死亡外其他菌株均存活；用酸处理1 min后( pH1.18 ) 检测，除了2株存活外。其他菌株均死亡。表明阪崎肠杆菌对酸有一定耐受性，不同阪崎肠杆菌菌株对酸的耐受性不同。 

3 讨 论

文献报道, 依据阪崎肠杆菌菌株的生化特性以及在婴幼儿配方奶粉溶液中的热耐受情况，可以将阪崎肠杆菌菌株分为热耐受和不耐受2种表型。本研究发现，分离自不同食品产品的阪崎肠杆菌菌株具有不同的生长特性、热耐受性和酸碱耐受性。提示有些阪崎肠杆菌菌株对于高温消毒和酸碱杀菌剂具有更强的耐受性。例如，巴氏消毒奶是牛奶经 62～65℃下处理30min ， 或72～75℃下处理15s后的牛奶，而对于一些热耐受力较强的阪崎肠杆菌菌株，这种消毒方法无法达到彻底杀灭的目的，可能需要采用如超高温瞬间杀菌 (UHT ) 等方法， 即将牛奶迅速加热到135℃保持2～4s 等其他灭菌方式才能较彻底地消除阪崎肠杆菌。 

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