黄连上清丸微生物限度检查方法学验证

【关键词】 黄连上清丸 微生物限度检查方法 验证

Abstract Objective：To verify the microorganism limited inspecting method of Huanglian Shangqing pill. Method：Plate counting method was used to count. Trail liquid and bacterial liquid， five bacterial liquids，dilute liquid and bacterial liquid，trail liquid were respectively injected into culture medium of trial group，bacterial liquid group，dilution bilingual group，trail liquid control group. Every trail recovery rate was calculated in three independent trails. The control bacteria checking method was verified by observing cultivation of Escherichia coli，coliform and positive staphybococcus aureus under the same environment. Result：The rate of every trail bacteria was higher than 70%，and the rates of five diluted trail bacterias were higher than 70%. Conclusion：The microorganism limited inspecting of Huanglian Shangqing pill can be used.

Key words Huanglian Shangqing pill; microorganism limited inspecting method; verification

黄连上清丸具有散风清热、泻火止痛的功效，用于治疗风热上攻、肺胃热盛所致的头晕目眩、牙齿疼痛、口舌生疮等。其疗效确切，患者认可，并为中国药典（2005年版）收载。生产企业为了适应市场需要和方便患者服用，申请将大蜜丸改变为水丸。现根据中国药典（2005年版）要求，对非规定灭菌制剂及其原料、辅料进行微生物限度检查，同时进行方法学验证。为确保检验方法的准确性和可靠性，对该品种的微生物限度检查进行了计数方法的验证及控制菌检查方法的验证，现将结果报道如下。

1 实验材料

黄连上清丸由山西万辉制药有限公司生产,批号为20050708，20050709，20050710。菌种包括枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］，由北京生物制品检定所提供［1］。培养基包括营养琼脂培养基（20050920）、营养肉汤培养基（20050822）、玫瑰红钠琼脂培养基（20060118）、改良马丁液体培养基（20060215）、改良马丁琼脂培养基（20060125），均由北京奥博星生物科技有限责任公司提供。

2 实验方法

2.1 菌液的制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10 mL营养肉汤中，35 ℃~37 ℃培养18 h~24 h，取此培养液1 mL加0.9%无菌氯化钠溶液9 mL，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使菌数约为（50~100）cfu/mL。接种白色念珠菌的新鲜培养物至10 mL改良马丁液体培养基中，23 ℃~28 ℃培养24 h~48 h，取此培养液1 mL加0.9%无菌氯化钠溶液9 mL，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-5，使菌数约为（50~100）cfu/mL。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，23 ℃~28 ℃培养5 d~7 d，加（3~5）mL 0.9%无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1 mL菌液加0.9%无菌氯化钠溶液9 mL，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4~10-6，使菌数约为（50~100）cfu/mL。以上菌液同时各取两份注入培养基培养。采用平皿计数法计数。结果见表1。

2.2 计数方法的验证

2.2.1 供试品溶液的制备 取供试品10 g，加入0.9%无菌氯化钠至100 mL，振摇，使成1∶10的供试液。

2.2.2 黄连上清丸微生物限度检查回收率测定 进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。试验组：取供试液1 mL，加入1 mL菌液［（50~100）cfu/mL］，注入培养基。菌液组：分别取菌液1 mL，注入培养基。供试品对照组：取供试液1 mL，注入培养基。稀释剂对照组：取稀释剂（0.9%无菌氯化钠） 1 mL，加入1 mL菌液［（50~100）cfu/mL］，注入培养基。以上各组试验均同时做两份培养，且各试验菌同时进行，采用平皿计数法。

2.3 控制菌检查方法的验证［2］

2.3.1 大肠埃希菌［3］

2.3.1.1 供试液的制备 取供试品10 g，加入0.9%无菌氯化钠至100 mL，振摇均匀，使其成为1∶10的供试液（未经高压蒸汽灭菌）

2.3.1.2 验证方法

试验组：取供试液10 mL，加到胆盐乳糖培养基100 mL中，作为供试品管。同法重复1份，加入大肠埃希菌76 cfu作为阳性对照管。另取与供试液等量的稀释剂加到胆盐乳糖培养基100 mL中作阴性对照管。35 ℃~37 ℃培养18 h~24 h，取上述增菌液0.2 mL，加入5 mL的4-甲基伞形酮葡糖苷培养基（MUG）试管中，置35 ℃~37 ℃培养5 h~24 h，观察荧光，再加入靛基质试剂观察结果。

阴性菌对照组：采用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。验证大肠埃希菌取胆盐乳糖培养基100 mL，按试验组同法操作，其中加入金黄色葡萄球菌75 cfu做阴性对照管。35 ℃~37 ℃培养18 h~24 h，取上述增菌液0.2 mL，加入含5 mL的MUG试管中，35 ℃~37 ℃培养5 h~24 h，观察结果。

2.3.2 大肠菌群

2.3.2.1 供试液的制备 取2.2.1项下的供试液1 mL，加入0.9%无菌氯化钠9 mL，即为1∶100的供试液，取1∶100的供试液1 mL，加入0.9%无菌氯化钠9 mL，即为1∶1 000的供试液。

2.3.2.2 验证方法

试验组：取10 mL的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入1∶10的供试液1 mL、1∶100的供试液1 mL、1∶1 000的供试液1 mL，作为供试品管。同法重复1份，加入大肠埃希菌76 cfu作阳性对照管。另取与供试液等量的稀释剂加到10 mL的胆盐乳糖发酵培养基管中作阴性对照管。35 ℃~37 ℃培养18 h~24 h，观察结果。

阴性菌对照组：验证大肠菌群，采用革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌，取10 mL的胆盐乳糖发酵培养基管3支，按试验组同法操作，其中加入金黄色葡萄球菌75 cfu作阴性对照管。35 ℃~37 ℃培养18 h~24 h，观察结果。

2.4 统计方法

供试品计数方法的验证检查进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。

控制菌检查方法的验证采用与试验组和阴性菌对照组同法的操作。

3 结 果

3.1 黄连上清丸微生物限度检查回收率测定

结果见表2。由表可知该供试品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌的回收率均高于70%，稀释剂对5种试验菌的回收率均高于70%。

3.2 大肠埃希菌和大肠菌群控制菌检查

结果见表3，表4。由表可见控制菌检查阳性菌生长良好，阴性菌均未检出。

4 讨 论

我们按照中国药典（2005年版）微生物限度检查法中常规法检验，首先将样品进行了细菌霉菌数测定，结果细菌数为4000 cfu/g，给方法学验证带来不便，故对制备好的供试液进行了高压蒸汽灭菌后再进行计数方法的验证。该供试品对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉5种试验菌的回收率均高于70%，稀释剂对5种试验菌的回收率均高于70%，故本品无抑菌作用。

按照中国药典（2005年版）微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查。控制菌检查阳性菌生长良好，说明本品对大肠埃希菌、大肠菌群没有抑菌作用。阴性菌均未检出，表明该控制菌检查方法的专属性好，可用于控制菌检查。

通过对本品的微生物限度检查计数方法的验证及控制菌检查方法的验证，在处方、生产工艺及检测环境不变的情况下，采用常规法可以进行本品的微生物限度检查。

【参考文献】
［1］国家药典委员会. 中华人民共和国药典（二部）［M］. 北京:化学工业出版社，2005：93-98.

［2］马绪荣，苏德模. 药品微生物学检验手册［M］. 北京:科学出版社， 2000：89-90.

［3］中国药品生物制品检定所. 中国药品检验标准操作规范［M］. 北京：中医药科技出版社，2005：335-341.

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