MTT法进行活菌计数的方法学探讨

目的：建立一种快速、稳定、灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法。

方法：以大肠杆菌为研究对象,探讨MTT法用于细菌计数的可行性及反应时间、测量细菌数量的范围、MTT的用量、是否加入溶解剂等实验条件。

结果：细菌数在3. 8×10⁷～1. 2×10⁹/ ml 范围内测出的OD值与细菌浓度呈良好的正相关 ,反应时间为20分钟,MTT 10μl、 20μl 均可,20μl 效果更佳。可不用溶解剂。

结论：MTT比色分析法可用于检测活菌数量。

关键词 　 MTT比色法;活菌计数;方法学

　　 在微生物学、免疫学以及其他学科的实验中,常用一定浓度的活菌作为实验材料,这就涉及到一个活菌计数的问题。微生物学用于细菌计数的常规方法有比浊法、分光光度计测定法、 平板倾注法或平板涂布法等。前两种操作方法简单,但只能测量细菌数量,不能判断细菌的活性;后两种虽然测量的是活菌数,但方法繁琐,重复性较差,所需时间长。MTT比色分析法由Mosmann在1983年首创,其原理是活细胞内的线粒体脱氢酶可将MTT(为一种淡黄色的四甲基偶氮唑盐)还原成蓝紫色甲月替,而且形成的量与活细胞数量成正比关系。此方法具有简单、快速、灵敏、稳定之特点,克服了常规方法的不足之处。MTT法目前大多用于免疫细胞及其他细胞的活性检测,未见用于细菌等微生物的活性检测的报道。本实验以大肠杆菌为研究对象,对MTT法用于测量活菌数的可行性及实验条件进行了探讨。

1 　 材料和方法

1. 1 　 细菌

将大肠杆菌的标准菌株(埃希氏菌 44664 ,购于中国药品生物制品鉴定所)培养于肉汤管,放37 ℃恒温箱孵育18～24小时,用比浊法定量后,倍比稀释成8种浓度。

1. 2 　试剂

MTT(sigma)溶于pH7. 4   PBS ,浓度 5mg/ml ,过滤除菌,4℃ 冰箱避光保存。二甲基亚砜(DMSO) 。

1. 3 　MTT比色法测定

取不同浓度的大肠杆菌肉汤培养物 ,加入 96 孔平底培养板(美国Nunc) ,每孔100μl ,各做5个复孔 ,按10μl/孔或20μl/孔加入 MTT溶液 ,放37 ℃恒温箱10分钟,20分钟,40 分钟后取出,加或不加 DMSO ,用全自动酶标仪(Bio - Rad450 型)于波长570nm下测定OD值。

2 　 结果与分析

2. 1 　 测量范围

甲月替是活细胞代谢的产物 ,由图1可见,其生成量随活菌数的增多而增加,细菌数在3.8 ×10⁷～1. 2×10⁹/ ml 范围内与OD 值成正相关 ,线性良好 ,其相关系数 r = 0. 9998 , P < 0. 01。

2. 2 　MTT的量对结果的影响　　 分别在细菌数相同的孔中加入 MTT(5mg/ ml )10μl 或20μl ,反应后测OD值 ,结果如图2所示,各孔OD值随MTT的量增加而有所增加,在测量范围内 ,细菌数与 OD 值均呈正相关 ,但加入的 MTT 量为20μl 时 ,相关性更好。MTT量为 10μl , r = 0. 9749 , P< 0. 01 ;MTT量为20μl ,  r = 0. 9998 , P < 0. 01。

2. 3 　 反应时间对结果的影响

在孔中加入MTT后 ,用肉眼可观察到浓度高的两孔(1.2×10⁹/ml 和 6×10⁸/ ml)几乎立即出现均匀的蓝紫色,放37 ℃ 孵箱 10 分钟后取出 ,发现除前两孔外,后几孔无明显变化 ,继续放孵箱 20 分钟、 40分钟后取出测 OD 值 ,反应 20 分钟 ,各孔的OD 值已有明显的梯度变化 ,OD 值与细菌数之间的相关系数 r = 0. 9998 , P < 0. 01 ;反应 40分钟后 ,测出的 OD 值稍有增加 ,OD 值与细菌数之间的相关系数反而降低( r = 0. 9735) 。实际测定中 ,反应20分钟即可。

2. 4 　 溶解剂对结果的影响

反应时间终止时 ,肉眼观察各孔中呈现深浅不同但很均匀的蓝紫色 ,倒置显微镜(40×)下观察 ,有大团分布均匀的蓝紫色颗粒,加入DMSO后 ,观察到颗粒变小、变少,但OD 值的测量加入DMSO前后OD值无显著差异。

3 　 讨论

活细胞体内的线粒体脱氢酶将淡黄色的MTT代谢后形成蓝紫色的甲月替,该物质在 560～610nm中有一个较宽的最大吸收峰,用酶标仪可对其进行直接测量,其值与活细胞的数量有良好的线性关系。

本实验对使用酶标仪测定活菌数量的 MTT法进行了探索 ,实验结果表明: ①细菌浓度在 3. 8×10⁷～1. 2 × 10⁹/ ml时,OD值与活菌数呈良好的正相关。此测定范围完全可满足一般检测的需要。② MTT的量用10μl 或 20μl 均可,但 MTT为 20μl 时 ,OD 值与活菌数间的相关性更好。③ 反应时间为20分钟时 ,OD值与细菌浓度呈良好的正相关 ,延长反应时间 ,OD 值与细菌浓度间的相关性反而下降。④加入MTT后 ,用肉眼及倒置显微镜观察 ,孔中呈现均匀的蓝紫色 ,测 OD 值也表明,加入DMSO 前后,结果没有显著差异,提示测量活菌数可不用溶解剂。这点和报道的检测其他细胞活性的 MTT比色法有所不同,可能与原核细胞和真核细胞代谢特点的差异以及反应时间不同有关 ,有待进一步探讨。

综上所述,我们认为 MTT比色分析法可用于测量活菌数量,较好的实验条件为每孔加 MTT (5mg/ml ) 20 μl ,37 ℃ 孵育20 分钟 ,可不加溶解剂,在 570nm波长测定OD 值。此法经济、简便、快速、稳定、灵敏度高,且测出的为活菌数量,具有传统细菌计数法所无法比拟的优点 ,可满足一般临床及基础检测的需要。

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