SPA的提取

1.煮沸提取法

     ⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上，37℃培养20h~24h。
　　⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下，配成10%（V/V）的悬液。
　　⑶ 水浴中煮沸1h，迅速冷却至4℃，4000r/min离心20min，去沉淀。
　　⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5，然后4000r/min离心30min。
　　⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min离心20min。
　　⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，4000r/min离心20min。
　　⑺ 沉淀（可直接冻干为粗提SPA制品）加PH7.4PBS液溶解，12000r/min离心20min。
　　⑻ 上清液即为粗提SPA液。
　　⑼ Sephadex G100过柱，上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱，流速控制在每管2ml~3ml/20min，收集流出液。
　　⑽ 测OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性，将有活性的各管合并、浓缩或冻干。

2.溶菌酶消化法

⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液配成10%~15%的悬液。
　　⑵ 按20：1（W/W）的量加入SPA菌液与溶菌酶（活力为1万U/mg蛋白）37℃水溶搅拌24h。
　　⑶ 置4℃冷却后，以12000g离心30min。
　　⑷ 取上清，调pH值至7.0。
　　⑸ 加硫酸铵，边加边搅拌，使溶液呈80%的饱和度，4℃过夜。
　　⑹ 12000g离心30min。
　　⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。
　　⑻ 透析或过Sephadex G50除盐，即为粗制的SPA制品。

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