厌氧菌的分离和培养

1.1 了解厌氧微生物的生长特性

1.2 观察厌氧微生物（双歧杆菌）的形态特征

1.3 掌握厌氧微生物的滚管分离、培养与计数技术

2 原理

目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。

亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。

亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害腐败菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。

3 材料

3.1 样品

双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。

3.2 培养基

改良MRS培养基，PTYG培养基。

3.3 仪器和器具

亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器 

4 流程

铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数

5 方法

5.1铜柱系统除氧

铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N₂、CO₂和H₂等通常都含有O₂，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H₂时，H₂与CuO中的氧就结合形成H₂O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。

5.2 预还原培养基及稀释液的制备

制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5-5ml，稀释液装9ml，并插入通N2气的长针头以排除O₂。此时可以清楚地看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。

5.3 双歧杆菌样品不同稀释度的制备

在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1ml混合均匀的液体样品，而后加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其震荡均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1ml 10-1稀释液至另一支装有9ml生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管培养计数。

5.4厌氧滚管培养法

将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于50℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于盛有冰块的盘中或特制的滚管机上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。每个稀释度重复3次，而后置于37℃（酸奶样品42℃）恒温培养箱中培养。一般培养24—48小时后，即可在厌氧管的琼脂层内或表面长出肉眼可见的菌落。

5.5 双歧杆菌活菌（分离）计数

选择分散均匀，数量在几十~几百个菌落的厌氧试管进行活菌计数，即可得出每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量。

5.6 计算

双歧杆菌的活菌数量cfu/g(ml)样品=0.1ml滚管计数的实际平均值×10×稀释倍数

6 结果

6.1 观察双歧杆菌形态，描述其形态特征。
 

6.2 计算每克或每毫升样品中含有的双歧杆菌数量，记录结果。

7 思考

1 比较平板活菌计数和滚管活菌计数的异同？

2 实验中通过哪些措施和方法保持细菌的厌氧状态？

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