农杆菌介导的植物遗传转化

录入时间:2010-10-27 9:05:18 来源：西北农林科技大学

（一）实验目的
1．全面了解农杆菌介导的植物转基因的方法；
2．根据已学的知识，设计一个农杆菌介导植物的遗传转化实验方案；
3．掌握农杆菌培养，植物外植体无菌系建立，农杆菌侵染和转化体筛选等一系列试验方法。
　　（二）培养基
1．LB培养基：每升含有：酵母浸膏 5 g ,胰蛋白胨 10 g ，NaCl 5 g ，PH 7.2
2．YEB培养基：每升含有：牛肉浸膏 5 g ，酵母浸膏 1 g ,蛋白胨 5 g ，蔗糖 5 g ，MgSO4·H2O 0.5 g ，PH 7.0

3．YEP培养基：每升含有：牛肉浸膏 10 g ，酵母提取液 10 g ，NaCl 5 g ，PH 7.0

4．实生苗培养基：1/2MS培养基，附加 30g 蔗糖和0.6％琼脂，PH=6.0。
5．预培养基：MS+1.0～1.2mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+ 30g 蔗糖+ 6g 琼脂，PH=5.8。
6．分化培养基：MS+0.2mg/L IAA+2.0mg/L 6-BA+ 30g 蔗糖+ 6.5g 琼脂+AgNO36mg/L，PH=5.8。
7．筛选培养基：分化培养基+AgNO3 6mg/L+500mg/L Cb+10mg/L Kan，PH=5.8。
　　（三）试验仪器
　　超级超净工作台
　　智能气候培养箱
　　大型落地式高速冷冻离心机
　　凝胶成像系统
　　台式常温高速离心机
　　立式灭菌锅
电泳相关设备
　　（四）农杆菌介导植物转化实验步骤（以油菜子叶转化为例）
1．根癌农杆菌的培养
　　将保存于甘油中的菌种用划线法接种于LB固体平板培养基上培养，每次转化前一天从平板上挑取单菌落接种于YEB液体培养基中，在 26℃ ，170r/min的摇床上过夜培养，当OD600值达0.3～0.5时，将其在4000r/min的条件下离心5min，弃去上清，然后用液体MS培养基将其重悬稀释5～8倍待用。

2．建立无菌苗
　　将油菜种子用75%酒精浸泡30s后，于0.1%HgCl2溶液中处理10min，无菌水冲洗3次后，接种于1/2MS固体培养基上，在25± 1℃ 黑暗条件下培养3d，后移至光下培养1～3d，取其下胚轴和带柄子叶接种在预培养基上，在 25℃ ，光照强度为2000lux，16h光照周期培养条件下培养，待用。
3．农杆菌侵染
　　在无菌条件下，将预培养2d子叶和下胚轴收集于一个无菌小烧杯中，浸入于活化并稀释了5～8倍的农杆菌液中，5min后转到无菌滤纸上，吸干多余的菌液，接至共培养培养基中，在 25℃ 生化培养箱中共培养2 d。
4．分化培养
　　将共培养2d的受体材料先用无菌水冲洗2～3次至水澄清后，用500mg/LCef浸泡30～40min，材料取出并置于含有无菌滤纸的培养皿中干燥2d。将培养物转移至附加8～15mg/L卡那霉素和500mg羧苄青霉素（或头孢霉素）的分化培养基中，在 25℃ ，昼夜光周期为16／8h恒定光照条件下培养，
5．筛选培养
　　将分化培养中获得的绿芽移置筛选培养基（卡那霉素浓度升致25mg/L），每隔15～20d转接一次。

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