醋酸杆菌最佳诱变剂的筛选

关键词：醋酸杆菌；诱变剂；盐酸羟胺；突变；青霉素

    醋酸杆菌在自然界中分布较广，例如醋醪、水果、蔬菜表面都可以找到，它是重要的工业用菌之一，能氧化酒精为醋酸，发酵调味品食醋，葡萄糖及维生素C的生产就是利用醋酸杆菌。目前国内醋酸生产菌株以中科1.41和沪酿1.01为主^[1]。目前水果醋以其食用及保健美容之功效，倍受大众青睐，为了找到适合水果醋发酵所用的优良菌种，有必要对醋酸杆菌进行诱变，诱变是遗传育种常用来培育优良菌种的方法，它主要包括物理因素如紫外线β射线、X射线等，化学因素如5-BU、芥子气、亚硝酸、烷化剂等，不同的诱变剂其诱变机理^{[ 2,3]}不同，有的是改变了DNA的化学结构或是导致碱基替换、移码突变或结合到DNA分子上等。本试验就主要依据各种诱变剂的不同诱变机理^[2,3]，选用了前述六种诱变剂对醋酸杆菌进行诱变处理和结果分析。             

1  材料和方法

1.1  材料

1.1.1  菌种

     醋酸杆菌，从苹果皮上自行分离的野生型菌种。

1.1.2  仪器设备

     手揿计数机、血球计数板、SW-CJ-IF超净工作台、YWQGO2型高压蒸汽消毒器、WC-1型微型涡旋混合仪。

1.1.3  试剂

     紫外线：波长为253.7nm,15w的紫外灯，作用距离为20cm；

     亚硝酸、吖啶橙(F.M.P) 、5-溴尿嘧啶： 中国医药上海化学试剂公司生产；    

2-氨基腺嘌呤：CHEMCAL COMPANY；

     盐酸羟胺：上海建新试剂厂生产；

     青霉素：80万单位 华北制药股份有限公司生产。

1.1.4  培养基

分离培养基：葡萄糖0.3g  酵母膏1g 碳酸钙1g  琼脂2g  酒精4%(v/v)加水至100ml；

    试管斜面培养基：葡萄糖0.3g  酵母膏1g  碳酸钙2g  琼脂2g  酒精4%(v/v)加水至100ml；

    种子培养基：葡萄糖0.3g  酵母膏1g  酒精3%(v/v)加水至100ml；

    发酵培养基：葡萄糖0.3g   酵母膏1g   酒精6%(v/v)加水至100ml。

1.1.5   培养条件

     分离培养条件： 30℃  42h ；液体酵条件： 30℃  160h

1.2  试验方法

1.2.1  测定野生型醋酸杆菌液体发酵产酸能力

     将冷藏菌种活化，分离培养，进行液体发酵，用酸碱滴定法测其酸度。

1.2.2  诱变处理

将培养好的试管用0.85%的无菌盐水洗下，倒入带有玻璃珠的的大试管振荡10～15分钟，配成菌悬液（1×10⁸个/ml），十倍稀释，涂平板^[4]，培养，与同步培养的野生型菌株进行比较，计算致死率(诱变后的菌落数／诱变前的菌落数×100%)。

(1)紫外线诱变处理

    将上述菌悬液置于紫外灯下照射，采用不同的照射时间，避光十倍稀释,用黑布包住培养42h,然后记数^[5]。

    (2)亚硝酸诱变处理

    取2ml一定浓度的菌悬液于一个已灭菌的空试管中，加2ml已水浴灭菌过1mol/l的醋酸缓冲液和不同体积的已过灭菌的0.2mol/l亚硝酸钠溶液作用十分钟，然后用0.7mol/l磷酸氢二钠稀释,分别涂平板记数^[4]。

    (3)吖啶橙诱变处理

    用电子天平称取适量的诱变剂水浴灭菌。取2ml一定浓度的菌悬液于一个已灭菌的空试管中，加入不同体积的诱变剂分别涂平板记数^[5]。

    (4)5-溴尿嘧啶诱变处理

    用电子天平称取适量的诱变剂水浴灭菌。取2ml一定浓度的菌悬液于一个已灭菌的空试管中,加入不同体积的诱变剂分别涂平板记数^[4]。

    (5)2-氨基腺嘌呤诱变处理

    用电子天平称取适量的诱变剂水浴灭菌。取2ml一定浓度的菌悬液于一个已灭菌的空试管中，加入不同体积的诱变剂分别涂平板记数^[4]。

    (6)盐酸羟胺诱变处理

    用电子天平称取适量的诱变剂水浴灭菌。取2ml一定浓度的菌悬液于一个已灭菌的空试管中，加入不同体积的诱变剂分别涂平板记数。

1.5.3  青霉素测醋酸杆菌对诱变剂的敏感性

    用电子天平称取适量的青霉素溶解，稀释，水浴灭菌。以不同的浓度加入到诱变后的菌悬液中，将未加青霉素的菌悬液与加青霉素的菌悬液分别涂平板记数，计算相对突变率(加青霉素的菌落个数/未加青霉素的菌落个数×100%)，找出突变率最高的诱变剂。

1.5.4  液态静止发酵试验

    用筛选出的最佳诱变剂诱变醋酸杆菌后涂于含有碳酸钙的平皿中，挑取透明圈与菌落直径之比较大的菌落接种试管斜面培养，24h左右后接入液体试管中，且酒精体积分数调到3%,培养24h后接入液体三角瓶中，最后酒精体积分数调到6%，培养7d,测其酸度，与野生型菌种同步比较，据酒精转化率高低选出产酸高产菌株.

1.5.5  高产菌株传代试验

将高产菌株传接五代，均测其发酵产酸能力，观察其遗传稳定性。

1.5.6           酸度测量方法：酸碱滴定法。

2             结果与讨论

2.1  致死率

    野生型苹果醋酸杆菌经不同诱变剂处理后，计算所得致死率

   依据大量资料，醋酸杆菌在偏低诱变剂剂量（70%～80%致死率）的情况下发生正突变的几率较高，故由图均选择致死率75%时的诱变剂剂量进行诱变。

2.2  青霉素检测诱变效果

2.2.1  青霉素用量将不同浓度的青霉素加入诱变后的菌悬液涂平板计数。结果青霉素效价为5ppm单位/ml和5000ppm单位/ml时，突变率为39.55%和41.53%。证明在此浓度下检测效果最好，故选用青霉素效价为500 ppm单位/ml为最佳剂量。

2.2. 2  将适当浓度的青霉素加入到最佳诱变剂量诱变后的一定浓度的菌悬液中，使最终效价浓度

为500ppm单位/ml，分别30ºC培养48h后计数。计算相对突变率。

 2.3  发酵试验结果

    与空白试验野生菌株相比，诱变菌株产酸量都有不同程度的提高。

3  结论

    通过本试验筛选出醋酸杆菌的最佳诱变剂为：盐酸羟胺。此试验结果不仅可以为定向提高醋酸杆菌产酸能力提供了很有意义的理论和试验依据，而且推动果醋的进一步发展。另外，用该诱变剂诱变后选得的高产菌株可进一步诱变或用于其他基础研究。

参考文献

[1]王博彦,金其黄.有机酸发酵工艺学.中国轻工业出版社,1992:392～407.

[2]盛祖嘉.微生物遗传学（第二版）,科学出版社,1997.

[3]无锡轻工大学.微生物学（第二版）,1990,(3):64～474.

[4]陶文沂.工业微生物生理与遗传育种学,北京：，中国轻工业出版，2000,(9):245～268 

[5]沈平.微生物学.北京:高等教育出版社,2000,(6):231～233.

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