植物组培中愈伤组织的培养

在植物组织培养过程，植物的细胞、组织、器官等均可作为外植体进行离体培养。依据外植体来源的不同，植物组织培养可分为愈伤组织培养、器官培养、花药和花粉培养、胚培养、细胞培养、原生质体培养。

 

 

愈伤组织是指在形态上没有分化但能进行活跃分裂的细胞团，细胞分裂疏松无序或较为紧密。在自然状态下，当植物体的一部分受到机械损伤、昆虫咬伤或风雪等自然灾害的袭击后，能够在伤口处形成疑团愈伤组织，起到修复和保护作用。在离体培养条件下，许多植物的外植体也会出现类似情况，在外植体切口处及其附近形成愈伤组织，所不同的是离体培养条件下产生的愈伤组织细胞具有再分化的潜力，即细胞能够分裂、增殖和分化出不同形态、执行不同功能的组织和器官。

愈伤组织培养技术是植物组织培养中一项很重要的技术，绝大多数植物在培养时都要先经过愈伤组织阶段，再进行形态发生过程。主要应用于研究植物生长发育及分化机制、遗传变异规律；还可用于大规模工厂化生产有用化合物，或作为原生质体培养材料来源等。

 

从培养的植物材料获得愈伤组织，大致可分为诱导、分裂和分化3个阶段。

用于诱导愈伤组织的植物材料是由已经分化的成熟植物细胞组成，如叶片是由表皮、叶肉和叶脉3部分组成，其构成的各种类型细胞均为已经分化的成熟细胞，大部分已经丧失了分生能力，不能进行细胞分裂。根据植物细胞全能性理论，即使是已高度成熟和分化的植物细胞，也还保持着恢复到分生状态的能力。

植物愈伤组织培养是利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原有发育方向，失去原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态，这就是脱分化过程。实现此过程可通过在培养基中添加植物生长调节剂，促使已分化的细胞改变原有代谢途径，为重新启动细胞分裂做准备。

诱导阶段的长短取决于该细胞原来的生理状态、培养基中植物生长调节剂的种类、含量和相对比例以及培养条件的因素。如菊芋的诱导期只需1d，胡萝卜的诱导期则需要几天时间。一般培养材料细胞的分化程度愈高或愈成熟，进行脱分化诱导也就愈加困难，需要的时间也就越长。在诱导期，通过一些刺激因素和植物生长调节剂的诱导作用，使其合成代谢活化，细胞内的合成代谢迅速进行，但是细胞的大小并没有多大改变。

外源植物生长调节剂对诱导细胞分裂效果最好，其在植物愈伤组织培养中得到广泛的应用。因此，依据实际情况，可通过调整生长调节剂的种类和浓度来诱导细胞进行分裂。经过诱导的植物细胞在内部生理上将发生显著的变化，如细胞质增加、出现活跃的原生质环流、储藏物质淀粉等消失，蛋白质和核酸的含量增加，为启动细胞分裂做准备。

分裂期是指细胞通过分裂方式，不断增生子细胞的过程。对一些植物来说，诱导细胞分裂和使细胞保持分裂能力可能需要相同的条件，即在同一条件下就可完成细胞脱分化全过程。但也有一些植物在完成短时间诱导后，需要改变培养基成分和培养条件，否则只能见到少量愈伤组织或或完全没有肉眼可见的变化。一般来说，诱导阶段需要较高浓度的生长素和细胞分裂素，细胞分裂阶段则要适当降低植物生长调节剂的浓度。植物细胞一经诱导，其外层细胞完成脱分化过程，细胞开始迅速分裂。在细胞体积变小，内无液泡，细胞核和核仁增至最大，RNA含量持续上升等。培养物的形态变化表现为外层细胞分裂迅速。

分裂期愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。如果在原培养基上继续培养，细胞将不可避免地发生分化，产生新的结构，但把组织块及时转移到新鲜的培养基上，则愈伤组织可无限制地维持在不分化的增殖状态。

外植体的脱分化因植物种类和器官及其生理状况而有很大差异，如烟草、胡萝卜等脱分化较容易，而禾谷类植物的脱分化较困难；花器脱分化较易，而茎、叶较难；幼嫩组织脱分化较易，而成熟的老组织较难。

分化期是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，出现形态和功能各异细胞的时期，其主要形态变化如下：

（1）细胞分裂部位和方向发生变化。分裂期细胞主要进行平周分裂（局限于组织外缘并于组织周缘平行的分裂），而在分化期开始后，愈伤组织表层细胞的分裂逐渐减慢，并停止。转变为愈伤组织内部深处的局部区域的细胞分裂，使分裂面的方向改变，出现了由分生组织构成的“瘤状结构”。

（2）形成分生组织瘤状结构和维管组织。迅速生长的愈伤组织是类似的，处于分化期的愈伤组织会形成由分生组织组成的瘤状结构，它们往往变成不再进一步分化的生长中心，而从其周缘产生扩展的薄壁细胞，其结果使一个活跃生长的愈伤组织形成一种“泡状”增殖的特征。在愈伤组织中，可形成维管组织，但通常并不形成维管系统，而是呈分散的节状和短束状结构，它可由木质部组成，或由木质部、韧皮部形成层组成。在所有生长调节剂中细胞分裂素对木质部诱导作用比较明显。

（3）细胞的形态大小保持相对稳定，体积不再减小，愈伤组织不再增殖。

（4）出现了各种类型的细胞，如管胞、筛胞、薄壁细胞、石细胞、色素细胞等。

 

在植物材料培养过程中，植物细胞经过脱分化过程和持续的细胞分裂而形成愈伤组织。在愈伤组织中形成一些分生细胞团，随后再分化出各种器官原基，甚至体细胞胚，进而发育成苗或完整植株。

愈伤组织培养中器官发生分为3个不同阶段：

（1）细胞增殖或离体外植体脱分化形成愈伤组织

（2）愈伤组织中形成一些分生细胞和瘤状结构

（3）在一定条件下，分生细胞逐渐转变成为纵轴上表现出单向极性器官原基，即分化出芽和根。

在植物组织培养中，当外植体形成愈伤组织后，可通过调整植物生长剂比例促使芽和根的分化。一般来说，生长素有利于愈伤组织形成根，细胞分裂素可促进愈伤组织形成芽。愈伤组织的器官发生顺序有4种情况：

①     愈伤组织仅仅有芽或根器官的分别形成

②     芽形成后，在其茎基部长出根而形成小植株

③     先形成根，再从根的基部分化出芽形成小植株

④     在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株小植株

植物的体细胞在一定条件下诱导形成的类似合子胚的结构称为体细胞，也称胚状体。在离体条件下，培养细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，最终形成具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。

细胞经由胚状体方式形成完整植株，与不定芽和根的发生相比，有以下3个特征：

①     具有两极性

②     胚状体与外植体维管组织之间无直接联系

③     胚状体维管组织分布呈“Y”形。