二、细菌鞭毛染色应用意义
细菌鞭毛是细菌的运动器官,幽门螺杆菌能够从强酸性的胃内腔穿过胃上皮细胞上的黏液层达到胃上皮细胞的中性环境,这就是鞭毛运动作用的很好例证。
细菌分类学常将细菌的动力测定作为鉴定细菌的重要试验,动力试验常用悬滴法、压滴法和半固体培养基法。但对于弱动力菌株悬滴法和压滴法的观察结果常为阴性,而使用半固体培养法可以得到阳性结果,谷海瀛发现,使用MTT半固体培养基更容易观察菌株的弱动力,但至少要培养72h才能观察到。Rhodes等已论述每株细菌每一菌体细胞上的鞭毛数量是不恒定的,同一株菌可以观察到甚至5种以上不同鞭毛数的菌体细胞,例如大肠埃希菌在鞭毛涂片染色后,可以发现菌体鞭毛数量1~10根,由于菌体细胞的鞭毛数量的多样化,可以看到多种鞭毛分布的菌体细胞,这种现象可能是与鞭毛基因表达有关,也可能与鞭毛脱落有关。
通过鞭毛染色,可以观察到鞭毛形态、数量和鞭毛在菌体分布的位置,鞭毛数量和在菌体上的分布位置是鉴定细菌的重要依据之一,根据鞭毛的这些特征,可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。
单端极鞭毛(monotrichous):在菌体的一端只有1根鞭毛,例如绿脓假单胞,但这个概念可能要改变,敏捷食酸菌(acidovorax facillis,曾称敏捷假单胞)、德氏食酸菌(acidovorax delafieldii,曾称德氏假单胞)、缺陷短波单胞菌(brevundimonas diminuta,曾称微小假单胞)、泡囊短波单胞(brevundimonas vesicularis,曾称泡囊假单胞)、栖稻假单胞(pseudomonas oryzihabitans)、腐败希瓦菌(shewanella putrefaciens,曾称腐败假单胞)。这些菌曾均被描述为单端极鞭毛菌现在证明这些菌均为一端有1~2根鞭毛,现可以重新定义这是单端双毛菌(bitrichous)。
丛鞭毛(lophotrichous flagella 或 multitrichous flagella)菌体细胞的一端或两端鞭毛数大于2,例如恶臭假单胞菌。
周鞭毛:鞭毛多少有些均匀分布于菌体细胞表面外周,由于文献没有定义鞭毛数,可以提出新的定义,如果菌体细胞鞭毛数多于3,且几乎均匀分布于该细胞表面,即为周鞭毛,例如肠杆菌科细菌。
侧鞭毛:分为单侧鞭毛(lateral flagellum)和多侧鞭毛(lateral flagella),单侧鞭毛就是菌体细胞侧边长有1根鞭毛,谷海瀛首次发现非O1型霍乱弧菌有单侧鞭毛。国内外文献提到的侧鞭毛(lateral flagella)系指多侧鞭毛,即菌体细胞侧边分布的多根鞭毛,形态上侧鞭毛和周鞭毛难以区分。9版伯杰手册在革兰阴性需氧杆菌、微需氧杆菌和球菌Group4的章节中,将Subgroup 4a80个菌属进行列表,把有鞭毛的细菌分为两类,即单端鞭毛菌和侧鞭毛菌。
例如,产碱杆菌属和土壤杆菌属等在此列表中为侧鞭毛,但在该手册的菌属特征描述中却为周鞭毛,Tison也认为一些弧菌在固体培养基上能够爬动(swarm),鞭毛染色为周鞭毛,这是周鞭毛和侧鞭毛在概念上的混淆。为了区别这两个概念,本研究将侧鞭毛定义为在液体培养时染色表现为单端鞭毛,而在固体培养上可表现为周鞭毛,这种双相性的周鞭毛应称为侧鞭毛,例如副溶血弧菌在液体培养时,为单端极鞭毛,固体培养时可见周鞭毛,曾被认为是周鞭毛实际应为侧鞭毛。Shimada等发现嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌22℃固体培养可以显示周鞭毛,但肉汤培养却是单端极鞭毛。Inoue等发现类志贺邻单胞菌25℃固体培养可以显示周鞭毛,但肉汤培养却单端丛鞭毛,谷海瀛也证实这些发现,根据上述侧鞭毛定义,这些周鞭毛均应是侧鞭毛。Kirov等的研究也证实了这一观点。
通常细菌培养温度和鞭毛生长温度是一致的,但也有例外,鞭毛生长温度应该根据测定细菌动力的最适温度来确定,有些细菌需要在室温下(20~25℃)培养进行鞭毛染色,例如耶尔森菌属。有文献描述李斯特菌的动力温度是20~22℃,这也是鞭毛的生长温度。谷海瀛发现,单核李斯特菌在35℃培养,进行鞭毛染色,效果也很好。
细菌鞭毛的主要生理作用是动力,在液体培养中表现为“泳动”(swimming motility),而在固体培养基表面表现为“爬动”(swarming motility),有些细菌如变形杆菌就可以爬动侧鞭毛菌也有这种特性,这对于鉴定细菌很有帮助。
在检测某些细菌的鞭毛抗原时,如果该菌株有动力,用血琼脂平板培养的细菌鞭毛染色未见鞭毛或者发现鞭毛脱落,再使用血平板培养的菌落做血清凝集试验,出现阴性结果,这种情况下应该使用肉汤培养物做血清凝集试验,亦可用诱导方法恢复。
利用细菌鞭毛染色技术,可以将有动力的细菌进行归类,特别是在细菌鉴定中具有否定作用。例如,某一菌株经鞭毛染色确定为单端极鞭毛菌,尽管这株菌氧化酶试验阴性,发酵葡萄糖,但也绝不能把它归为肠杆菌科细菌进行鉴定。又如某一非发酵菌株,产生水溶性荧光色素,鞭毛染色为丛鞭毛,但它绝不对绿脓假单胞菌。因此,为了更准确地鉴定细菌,细菌鞭毛染色方法应该作为常规技术在临床实验室广泛应用。
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