新型微生物抗菌除臭菌系的研究与应用（2）

3 微生物抗菌除臭的意义和存在的问题

近年来恶臭污染会对人体产生不容忽视的危害以及各国对恶臭造成的环境污染的关注,对恶臭的处理研究也日益活跃。虽然微生物脱臭法的历史尚短、部分工作还停留在实验阶段，但由于其具有传统方法不可比拟的优势性和安全性，发展潜力和应用前景相当广阔。微生物抗菌除臭技术及微生物抗菌除臭剂在研究与应用中的意义及优势如下：

（1）纯绿色环保性质。由于微生物除臭技术是利用能够转化或者降解恶臭物质的特殊微生物的高效吸附、吸收和降解作用对恶臭气体进行净化，化恶臭为无臭。不含任何化学药品，也不含转基因产品成份，不会造成二次污染，代表着生物环保产业发展的未来方向。
    （2）处理功效高。运用微生物除臭技术大大增强了其处理污染的功效，与一般化学方法和生物方法相比较，微生物除臭技术对有机物的降解速度是传统方法的100倍。污染物在投放微生物除臭剂，可迅速祛除臭味，净化水质，降低COD、BOD5、氨、氮等指标。
    （3）适应性更广。微生物除臭技术特别是混菌微生物除臭剂降低微生物生存条件要求，增强适应性，减少过滤，适应多种温度和pH值范围，在低氧环境中也能有效发挥作用。
    （4）更有针对性。微生物除臭技术可广泛适用于不同领域、不同用途和不同的污染环境；并可根据具体治理对象的具体情况，专门研发出针对性的、最具效力的配方。
    （5）治理成本最低。微生物除臭技术品具有标本兼治的特点，不用征地建厂或购买庞大设备，综合治理成本和动态投资成本最低，而治理效果显著。

（6）化害为益。以前认为不能回收利用污染物，城市污水厂的污泥经微生物除臭制成肥料，如氨和硫酸化合成硫酸铵肥料，其中各种元素可被植物吸收；提高了污泥中有机碳的利用率；而且脱臭微生物大多是土壤中的有益菌群。
    （7）微生物除臭剂与传统化学产品比较。每种化学产品都是针对性强的产品，当遇有复杂的其他化学基质时，便会失效；使用化学产品之后，在水体中总有化学残留物，它可能带来副作用或新的污染；使用化学产品可掩盖臭味，却不能改变臭味的生成或阻止其散发。微生物除臭技术是利用自然分解和在分解过程中的积极生化作用，不会产生上述问题。

（8）微生物除臭剂与传统生物净化剂相比。微生物除臭技术可以极大祛除臭味，使液体状污物、有机物质迅速新陈代谢，减小固体物质体积，快速净化被污染物质。

微生物脱臭法具有传统方法所不可比拟的优越性,如处理效率高、无二次污染、所需的设备简单、易操作、费用低廉、管理维护方便等,其发展潜力和应用前景是相当广泛的。但是由于受研究和发展时间的限制,微生物脱臭尚有许多亟待解决的问题,主要有:①适合于特定恶臭有机物降解的微生物菌种筛选和驯化的方法;②恶臭气体的去除率与工艺参数之间的关系还需要定量化;③装置与设备的设计制造和施工还需规模化;④对高浓度的恶臭废气、复杂的混合气体处理还有待研究;⑤混菌发酵工艺有待优化。

4 本项目的研究内容

本项目是围绕上述主题开展了《新型微生物抗菌除臭菌系的研究与应用》的研究，课题下达单位为陕西海浪精细化工有限公司，承担单位为陕西西安海浪生物研究所、西北农林科技大学和其它相关单位。

通过课题组科研人员大量试验、技术创新、有效的管理和夜以继日的辛勤劳动，圆满地完成了课题规定的任务，取得了如下主要技术成果：

4.1 抗菌除臭菌株的分离筛选研究

自然界中微生物资源极其丰富，土壤、水、大气、动植物及其腐败残骸都是微生物的主要栖居和生长繁殖场所，在这些场所可以寻找有益微生物。随着微生物学研究工作的不断深入，新的微生物菌种资源开发和利用的前景十分广阔。分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、样品处理、富集培养、分离培养、纯化、性能测定和菌种鉴定等步骤。

4.1.1 抗菌除臭菌的采集和分离

本研究从采自秦岭山区不同地区、不同海拔、不同植被的156个土样中分离出了3230株微生物。

共采用3种方法进行分离：（1）划线分离法，即用接种针挑取微生物样品在固体培养基表面划线，适当条件下培养，获得单菌落；（2）涂布分离法，涂布棒蘸取培养液，或先将少量培养液滴在固体培养基表面，再用涂布棒再固体培养基表面涂布均匀；（3）稀释分离法，获得纯种的几率较大，该法是将降至60℃左右的固体培养基与一定量的菌悬液混匀后，再浇注成平板以获得单菌落。

在采集的样品中，待分离的具有除臭能力的菌株在数量上并占优势，为提高分离效率，课题组成员以投其所好和取其所抗的原则采用在培养基中投放和添加特殊的养分或抗菌物质对所需菌种进行增殖培养或富集培养，使所需菌种的数量相对增加，使天然样品中的劣势菌转变为人工环境中的优势菌，如:将样品按30％的接种量加入新鲜猪粪中，反复富集至猪粪无臭化。以无臭猪粪为起始菌种添加到模拟有机垃圾中进行驯化培养。

通过以上方法，本实验从采集的样品中共分离到3230株微生物，进而进行除臭菌的筛选。

4.1.2 除臭菌的筛选

所有的微生物育种工作都离不开菌种筛选,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤。为了提高筛选效率，本实验将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。对于初筛，要力求快速、简便；对于复筛，应该做到精确，测得的数据要能够反映将来的生产水平。

根据所需菌株的特性，本实验自制了简单的初筛培养基：残菜400g，鱼头、内脏、肉渣100g，水800ml，煮沸30min，过滤，调滤液pH7.0，琼脂2%。按10%接种量接入所试菌株，分别在5d、10d、15d后用感官法初步判定微生物的除臭效果。初筛工作连续进行几轮。初筛出具有除臭能力的中温和耐高温微生物及其除臭效果结果如表4：

表4 中温和耐高温微生物除臭效果

从表4中可见，分离的微生物中除臭能力各异，有效百分比最低的是放线菌，为13.40%，最高的为41.66%，而且，耐高温或嗜热的细菌、真菌、放线菌，无论从有效菌株还是从有效百分比都表现出除臭能力低于其各类的中温微生物，这初步说明在常温条件下，中温微生物的除臭能力高于耐高温微生物，或者表明除臭微生物的优势菌群可能属于中温微生物。进而对初筛实验中有除臭效果的微生物进行分类编号和复筛实验。

除臭微生物复筛过程采用官能检测法和臭气组分测定法两种方法相结合。官能检测法是通过嗅辨人员利用其嗅觉对被检测物质进行嗅味辨别,然后通过计算得出检测结果，它包括现场官能检测法和室内液体稀释法；液体稀释法现场取鸡粪便样,在试验室内经过定量、水溶、过滤、稀释、嗅辨、数据处理等步骤,得出试验组和对照组鸡粪便恶臭程度，最后分析以确认除臭效果。臭气组分测定法主要是测定臭气中主要成分—氨气和硫化氢的量：用硼酸吸收凯氏法测定氨气的量，用锌铵络盐吸收比色法测定硫化氢的量。

通过上述两种复筛试验方法，我们共筛选出73株具有强除臭能力的菌株，其中细菌、丝状真菌、放线菌、酵母菌分别为32、13、8、20株。

4.1.2 体外抗菌菌株的筛选

根据微生态学原理,用普通培养基和选择性培养基相结合的方法,自分离的固有菌群中进行致病微生物抑制试验,以筛选拮抗菌。试验具体操作参照西安交通大学医学院微生物教研室进行的体外抗菌试验。

试验采用平板稀释法和杯碟法,自分离出3230个菌株中初筛拮抗菌株,得出38株对普通大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用；复筛得出10株对猪源弱毒型大肠杆菌(E.coli,C83917)Ｏ_{9:K103,987P:NM}有抑制作用。

4.2 微生物抗菌除臭菌的初步鉴定

经初步鉴定本试验分离到的抗菌除臭微生物主要种属类别如下：

表5  抗菌除臭微生物的种类

本实验筛选的除臭菌株主要是光合细菌类、醋杆菌类、乳杆菌类、芽孢杆菌类、假单胞菌属、链球菌类、酵母菌、丝状真菌以及放线菌类，共计12个属73个种的微生物。现就主要种属的除臭菌简介如下：

(1)光合菌群

光合细菌(Photo Synthetic Bacteria 简称：PSB)属细菌中的一类，有紫硫菌、绿硫菌、紫色非硫细菌和绿色非硫细菌。本实验室分离到的兼性厌氧菌主要是紫色非硫细菌，属原核生物界，光能异养型原核生物门，红色光合细菌纲，红螺菌目(Rhodospirillales)，红螺菌科(Rhodospirillaceae)，红假单胞菌属(Rhoropseudomonas)和红螺菌属（Rhodospirillum）。
　　光合菌群(好气性和嫌气性)，如光合细菌和蓝澡类。光合菌群由自养微生物分离而来，具有化害为利的特殊功能，即可将有害物质转变成为无害物质，并以植物的分泌物、有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氨等为基质，合成糖类、氨基酸类、维生素类、氨素化合物和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的主要组成部分。光合菌群的代谢物质可以被植物直接吸收，也可以成为其它有益微生物的营养物质。因此，随着光合菌群的增殖，其它有益微生物也相应增殖。

(2) 乳酸菌群

乳酸菌（LAB,Lactic acid bacteria）是一类能从可发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）产生大量乳酸的细菌的统称，目前已发现的这一类菌在细菌分类学上至少包括18个属，主要有：乳酸杆菌属（Lactobacillus）,双歧杆菌属（Bifidobacterium），链球菌属（Streptococcus）等,本实验主要筛选的主要是乳酸杆菌属（Lactobacillus），链球菌属（Streptococcus）的若干个种。

乳酸菌群（嫌气性）它以摄取光合细菌、酵母菌产生的糖类等物质为基础，制作乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动，以及有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够使常态下不易分解的木质素和纤维素等变得容易分解，并且消除未分解有机物产生的种种弊端，在有机物发酵分解上发挥突击队的重要作用，它将未腐熟的有机物质转化成对动植物有效的养份。乳酸菌的另一个重要作用，就是能够抑制连作障碍产生的致病菌增殖。一般情况下，致病菌如果增加，植物就会衰弱，有害线虫也会急剧增加。乳酸菌抑制了致病菌的活动，有害线虫也逐渐消失。

(3) 假单胞菌类

本实验从土壤中分离到具有很强抗菌除臭能力的一株荧光假单胞杆菌陕西变种（Pseudomonas fluorescens var shanxigensis）。荧光假单胞杆菌广泛存在于土壤中，是定殖于植物根际的优势细菌种群。由于此类细菌大量存在于植物根围，又称根际细菌（Rhizobacteria）。此类细菌以其分布广泛、适应能力强、繁殖速度快、易于人工培养、对许多病原菌具有很强的拮抗作用，成为近年来报道最多、最具生防潜力和应用价值的生防菌。                                                                                     
    (4) 酸母菌群

酸母菌群（好气性）它利用氨基酸、糖类及其它有机物质产生发酵力，产生出促进细胞分裂的活性化物质。酵母菌菌群中对于促进其它的有效微生物（如乳酸菌、放线菌）增殖所需要的基质（食物）的生产提供重要的给养保障。此外，酵母菌生产的单细胞蛋白是动物不可缺少的有效养份。

(5)放线菌群

放线菌（好气性）是细胞和霉菌的中间形态。它从光合细菌中获取氨基酸、氨素等作为基质，产生出各种抗生物质，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌组成的混合菌群，其抑菌作用比单一放线菌成倍增加。另外，被放线菌分解的物质容易被动植物吸收，从而增强动植物对各种病害的抵抗性和免疫性。

本研究获得了一株新的链霉菌变种，即委内瑞拉链霉菌秦岭变种，该变种具有很强的抑菌活性。
    (6)醋酸菌群

醋酸杆菌（好气性）它是氨素合成中具有代表性的微生物。它从光合细菌中摄取糖类固态氮，然后一部分供给植物，另一部分再还给光合细菌，形成好气性和嫌气性细菌结构的共生态。

4.3 新型微生物抗菌除臭菌系的发酵工艺研究

微生物抗菌除臭菌系是一种新型复合微生物活性菌群。它由光合菌类、醋酸杆菌类、放线菌类、乳酸菌类、酵母菌类及假单胞菌类六大菌群微生物组成的一个功能群体，如何将上述好气性微生物和嫌气性微生物按一定的比例加以混合培养,形成多种多样的微生物群落，各微生物在其生长过程中产生有用物质及其分泌物形成相互生长的基质和原料，通过相互共生、增殖关系形成一个组成复杂、结构稳定、功能广泛的具有多种多样细菌的微生物群落的生物菌群，是一个非常复杂的待解决的问题，其本身的生产工艺更表现出世界性的高科技水平。

混合菌液体扩大化发酵工艺流程：

培养基 → 种子发酵罐 → 生产发酵罐→ 除臭剂发酵产品

原始斜面→  活化斜面→ 摇床种子

4.3.1 培养基的选择

根据所用菌种和发酵目的物的特性，对碳源、氮源、无机盐、生长因子等营养物以及促进剂、缓冲剂等添加物逐个进行了单因子试验，了解这些因子对菌体生长和产物特性的影响，综合了各种因素的相互关系，进行正交试验，得出如下表6得培养基的成分及配制：

表6　培养基成分

4.3.2 种子发酵

种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。优良的种子可以缩短生产周期、稳定产量、提高设备利用率。我们针对所选菌种设计了自己种子制备方案和种子质量控制措施：（1）在将放线菌、酵母菌、醋杆菌接种至三角瓶，摇床培养；摇床转速180r/min，温度控制在28℃。（2）光合细菌的培养：将光合细菌接种至半密闭细口玻璃瓶（3L）,室温，光照（1000Lux）培养,间隙摇动。（3）乳酸菌的培养：将乳酸菌接种至密闭细口玻璃瓶中，28℃下静止培养。

4.3.3 混合菌株的广大化培养

根据微生物共生互惠这一特性，在研究单菌培养技术和所选除臭微生物互生现象的基础上，创建自己新型的微生物抗菌除臭剂菌种及发酵体系。

大罐液体发酵法一般生产工艺流程为：菌种接种掊养→种子罐培养→生产罐培养→排放培养液加入适量载体→除臭产品。此法适于工业化生产，便于无菌操作。

将各菌株的种子发酵液按一定的比例接入混合菌生长的合成培养基中，按照一定的工业发酵流程进行发酵，发酵过程中同时进行监测发酵液中的活菌数以及除臭定性实验。

4.3.4 混合菌的培养条件研究

在除臭混合菌的培养过程中,为了迅速得到量大,价廉的高活性细胞，必须为之创造一个良好的生存环境，比如：适宜的湿度、pH值、氧气含量、温度和营养成分等。为探索培养基各组分及培养条件对发酵质量的影响，本研究在基础培养基中增减或更换某种因子的种类和数量，找出最佳组合。

4.3.5 应用混合菌工业发酵的最佳流程的选择

用生物法处理环境中恶臭污染时,处理系统中高效微生物的数量与分解污染物的活力是运行中的关键问题之一。除培养条件等影响因素外,很大程度上取决于最适宜的发酵工艺流程。

表7　最佳发酵工艺流程的选择¹⁾

1)细胞浓度为5mg·mL^-1湿菌体,好氧为30℃摇床培养,缺氧为静止培养

由以上试验可知：该混合菌群生长的pH和温度范围较广,pH为4～10,最适pH5～7,温度为15～37℃,最适为30℃.生长碳源以红糖最优,有机氮优于无机氮.利用混合菌完整细胞对鸡粪/猪粪处理效果表明,当细胞浓度达20mg·mL^-1时只需通气20min就可将臭气完全去除.从通气条件看,好氧和缺氧交替进行有利于处理效果的提高。

4.4 新型微生物抗菌除臭菌系的应用试验

4.4.1 对生活污水的除臭

取家庭厨房洗米、洗菜、洗鱼等混合污水，将其放置几天发出恶臭后，取混合菌液不同浓度的投放量对嗅阈值的不同的污水进行除臭处理，测定不同浓度菌系菌液的投放量对污水除臭效果的影响。实验表明：当液体菌系的投放量为污水的0.1%时，除臭效果最好；并且用对不同嗅阈值生活污水除臭处理，结果是当污水的嗅阈值越高时，除臭的效果越显著．这被认为是污水中含有较多的营养物质，使所加菌种的活性较高，进而除臭效果较好。

4.4.2  池塘、湖泊等自然水体臭污水处理试验

　　采用在西安某公园池塘中的臭污水中投加微生物抗菌除臭菌系菌液的方法,系统评价了微生物抗菌除臭菌液对污水中三类常见污染物去除率的影响。结果表明:①好氧条件下,微生物抗菌除臭菌系菌液显著提高污水CODcr去除率的适宜加入量(Ｖ_菌液/Ｖ_污水)为5/10000-1/1000,增幅达10%;②微生物抗菌除臭菌系在好氧条件下能显著或极显著提高污水NH₄⁺-N的硝化程度,当除臭剂加入量为5/1000时效果最好,增幅达37.62%;厌氧条件下,当加入量为1/10000-1/1000时,能极显著增强污水的反硝化作用,NO₃^--N的去除率约提高14%。③微生物抗菌除臭菌系加入量大于5/1000时,才能显著提高污水的除磷能力。由试验可知：微生物抗菌除臭菌系可以有效地降解污水的有机物质，降低氮、磷的含量，增加水体的透明度，改善底泥颜色并且有效去除异味。

4.4.3 室内垃圾除臭实验

于一间密封的房间内放一堆已高度腐烂的产生恶臭的垃圾（主要是生活垃圾），在垃圾周围设置不同的采集地点进行采样和喷药，各测定喷药前及喷药后15min恶臭中的NH₃、H₂S浓度。试验结果表明抗菌微生物除臭菌系对生活垃圾具有明显的除臭效果，NH₃最高去除率可达82.98%，H₂S的最高去除率可达78.33%。

4.4.4 新型微生物抗菌菌系净化畜舍空气效果的实验

运用喷洒法将除臭菌系按每m³空间往地面上均匀撒放液体除臭菌系，测定氨和硫化氢的浓度。栏舍内5点采样，取平均值，重复实验5次。结果表明,本除臭剂可使鸡舍内的氨和硫化氢分别平均降解72.5%和81.8%,舍内空气氨和硫化氢分别平均降到16.8 mg·m^-3和3.9 mg·m^-3,可明显降低鸡舍内的臭味。研究表明,本除臭菌系是目前净化畜舍空气较好的净化剂。

4.4.5 养殖厂鸡舍主要致病性微生物的监测及抗菌试验

对杨凌、宝鸡、高陵等地5家养鸡场鸡舍空气主要致病性微生物的污染情况进行调查的基础上，应用新型微生物抗菌除臭菌系进行消毒，比较处理前后的主要致病性微生物的变化。结果表明：处理后鸡舍空气中含致病微生物显著降低。总细菌杀灭率达86%～94%，大肠杆菌杀灭率达88%～99%，葡萄球菌杀灭率达87%～94%，霉菌杀灭率达91%～96%。一般认为鸡舍空气细菌杀灭率达80%以上为良好，我们监测消毒后鸡舍空气含3种主要致病菌的杀灭率达78%～95%，证明抗菌微生物除臭菌系对鸡舍空气中致病菌有较强的杀灭作用，达到预期环境控制目的。同时试验结果还表明利用抗菌微生物除臭菌系与市售的高效广谱消毒药易克林具有同等的抗菌效果。

4.4.6 家用电冰箱抗菌除臭实验

为了解家用冰箱的细菌与真菌污染情况，科研人员对56台使用中的冰箱采样112份进行检测，观察冰箱细菌和真菌是否超标。将新型抗菌除臭菌系菌液稀释成不同浓度按一定的投放量对家用冰箱进行喷洒除臭处理，测定除臭菌液对冰箱臭味的去除能力及不同浓度菌液的除臭菌系对冰箱除臭效果的影响。实验表明该除臭菌系对冰箱中的臭气有很好的除臭效果。

4.4.7 微生物抗菌除臭菌系对运动鞋的抑菌除臭试验

为了测试微生物抗菌除臭菌系对运动鞋的抑菌除臭试验,在实验室及现场对该样品进行了抑菌试验和皮肤刺激试验。喷雾法检测微生物抗菌除臭菌系对运动鞋的抑菌效果试验;试验结果表明该微生物抗菌除臭菌系原药对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌抑菌率分别为93%和95%，将原药稀释240倍，对金黄色球菌抑菌率为90.95%；对白色念珠菌抑率90.90%。现场试验结果表明，用原有益菌群制剂进行喷雾，对鞋内自然污染菌平均抑菌率为97.06%，皮肤刺激试验表明该样品对皮肤无刺激。该产品适用于对鞋袜的抑菌除臭。

综上所述，本课题在有关部门的大力支持下，经过研究小组成员的多年努力，在经历许多挫折和失败后，经过大量的试验研究，特别是在试验初期（样品采集、微生物的分离纯化、除臭菌的筛选等方面），不断地克服困难，总结经验，努力进取，才取得了上述研究结果，希望该成果无论在理论上还是在生产实践中，能在恶臭治理方面发挥其积极作用，为我国环保事业做出一点贡献。

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