《水生微生物实验法》——几丁质分解菌的分离

（十二）几丁质分解菌的分离

几丁质也称壳多糖或称甲壳素，广泛地分布于海沙、海泥、海水、淡水和土壤，以及吃几丁质的头足类动物的胃肠，虾、蟹体表中．如几丁色色杆菌、嗜几丁杆菌、呈色几丁杆菌和蚀几丁芽孢杆菌等。它们将几丁质分解成中间产物醋酸与还原糖，最终产物为二氧化碳与氨．

1 ．几丁质培养基制备

（1）几丁质的制取：洗净蟹壳或将大海虾壳浸泡在l%HCl 中7 天，( 2 天换盐酸溶液1 次）脱去壳的钙质，使壳变得柔软而有韧性。然后用水洗净外壳，剪成1×3 厘米壳条。

用2 %氢氧化钾溶液浸泡壳条10 天，每2 天加热一次，加热的温度低于沸点为宜，借以除去几丁质以外的其他物质，如色素和蛋白质等。

用蒸馏水洗净壳条上的碱，然后用乙醇抽提数次．直到全部颜色脱净为止。

这样的几丁质适用于液体培养基培养未纯化的细菌，和保存几丁质分解菌．

如用于琼脂培养基中的几丁质，必须将这种去净杂质的几丁质研细分散于培养基中．这可用去杂质的若干几丁质条放于3 升的瓶中，在另一个烧瓶中准备好1500毫升冷水，用100 毫升5%的硫酸加到装几丁质条的烧瓶中，当几丁质刚溶解完时，迅速加入已准备好的1500 毫升冷水将酸稀释，静置过夜，使几丁质重新沉淀出来，轻轻倒出上清液．反复离心，洗涤沉淀至使石蕊呈中性。或将几丁质放在一个透水的玻璃纸袋里悬挂在流水中，使酸透析完全。

按1：10，使几丁质重新悬浮于水中。取5 毫升悬液于直径10 厘米培养皿时，以仍呈轻微而又清晰的乳白色为宜。

将悬液分装于试管中，每管10 毫升，于121 ℃ 下灭菌15 分钟。

（2）几丁质无机盐培养基制备：

K₂HPO₄   1.0克

MgSO₄·7H₂O  0.5克

NaCl 海水菌用30克   淡水菌0.5克

CaCl₂·2H₂O   0.1克

FePO₄·2H₂O  0.001 克

NH₄Cl 1.0克

H₂O  1000毫升

溶解上列无机盐类，调pH 为7.0分装于试管中，每管10毫升，各管加l 条去杂质的几丁质条，于121℃ 蒸汽下灭菌15分钟，冷后保存待用，

（3）无机盐琼脂培养基：将上述培养基的无机盐成分全部溶于水后，加入2％的琼脂（不加几丁质）加热溶解之，调pH 为7.0 ，分装于试管中，分与每管5 毫升和10 毫升的两种，在121 ℃蒸汽中灭菌15分钟.

（4）几丁质琼脂平板培养基：融化10 和5 毫升的无机盐琼脂培养基各若干管（视实验要求），于水浴中冷至45℃ 将一份10 毫升培养基倒入无菌的培养皿，静置．

在5 毫升培养基管中加入0.5 毫升温热的几丁质悬液，充分混和，倒入上面平皿中的无机盐琼脂平板上层。

这种作法能缩短几丁质分解菌作用子几丁质的时间。

2 ．几丁质分解菌富集培养

取样品接种于含有几丁质条的上述无机盐培养基中，在适温下培养至几丁质产生明显的分解后，移种到装有同样培养基的试管内，再培养待用。

3 ，分离和纯化培养

当分解几丁质变快时，将无机盐增菌培养液涂抹或划线于几丁质琼脂平板上，于适温下培养，待长出菌落后，可挑其菌苔，按一般方法纯化，保存于液体培养基中．当几丁质条接近消失时再移种。

4 ．供参考的培养基

（1）几丁质琼脂培养基：

K₂HPO₄  0.7克

KH₂PO₄   0.3克

MgSO₄·7H₂O  0.5克

FeSO₄·7H₂O   0.01克

ZnSO₄   0.001克

琼脂10 克

蒸馏水1.0升

Ph7.0

以上为基础培养基，以121 ℃ 蒸汽灭菌20 分钟、每100 毫升加20毫升胶体几丁质悬浮液和5 毫克放线菌酮，或制成用于分离放线菌的双层平板．底层用基础琼脂和放线菌酮，上层用胶体几丁质培养基。

（2）胶体几丁质的制备：取净几丁质15 克加浓盐酸100 毫升，于冰浴中揽拌20分钟，离心，将上清液倒入冷蒸馏水中使再沉淀，同时将沉淀物用浓盐酸再行处理，如此重复数次。最后加足蒸馏水于沉淀物中，搅拌，便成奶油状，再用氢氧化钠溶液调pH 至7.0 ，分装入广口瓶，每瓶20毫升121 ℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。

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