猪链球菌分离鉴定及药敏试验

    猪链球菌是一种人畜共患的传染性疾病，有 I、 I I 两个型， 其中I I 型最多见，可致猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、多发性浆膜炎、流产和局部脓肿。本菌主要通过创口感染人，引起人链球菌中毒性休克综合征( STSS ) 和链球菌脑膜炎综合征( SMS ) ，给养猪业及公共卫生构成了严重的威胁。2007年春，吉林省某猪场猪群相继发生了一种以高热、 跛行、神经症状为特征，致死率极高的急性败血性传染病，笔者采集了病、死猪病料分离到 1株细菌，通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、生化试验、血清学试验、菌体脂肪酸分析、动物致病性试验等系统鉴定，确定为猪链球菌I I 型。并经药物敏感试验，采取措施控制了疫情，现将结果报告如下。 

1 材料与方法

1.1病料来源

采自吉林省某猪场病死猪的病变肺脏、心血、肠系膜淋巴结、肝脏、心包液和病变关节液。 

1.2主要试剂及仪器

鲜血琼脂、普通琼脂、 麦康凯琼脂、 半固体糖发酵培养基、 血清肉汤培养基、 匹克氏增菌液按常规方法制备。 猪链球菌 I I 型诊断血清购自荷兰 DL O公司。质控菌株ATCC49619、ATCC25922购自中国药品生物制品鉴定所。青霉素钾、链霉素、庆大霉素、头孢拉定、复方新诺明、万古霉素、氨苄青霉素、氨苄西林、环丙沙星、利福平、红霉素、 克林霉素和罗红霉素等l3种药敏纸片分别购自上海卫生技术服务公司生物试剂所和北京天坛药物技术开发公司。 

1.3实验动物

小白鼠、3 0日龄仔猪 ( 吉林农业大学实验动物中心提供) 。 

1.4细菌的分离与鉴定

1.4.1细菌的分离  将所采病料分别涂片，革兰氏染色镜检，然后无菌采取病料于鲜血琼脂平板上划线分离，3 7℃有氧条件培养24 h ， 可疑菌落接种于匹克氏增菌液， 3 7℃培养24 h ，挑取单个菌落经涂片、染色、镜检，证实为纯培养物，将其接种于鲜血琼脂斜面上进行培养，得到纯培养物。 

1.4.2形态结构、 染色特性与运动性检查按常规方法进行。   ． 

1.4.3培养特性试验分离菌接种于血清肉汤、普通琼脂平板、鲜血琼脂平板，麦康凯琼脂平板等培养基中，3 7℃有氧条件下培养观察其生长表现。同时另一组置于厌氧罐中3 7℃培养观察其生长表现。 

1.4.4生化试验 用分离菌纯培养物进行蔗糖、山梨醇、棉实糖、葡萄糖、甘露醇、蕈糖、乳糖、菊糖、水杨苷、马尿酸钠试验。 

1.4.5血清学试验  玻片凝集试验： 将纯菌经缓冲肉汤培养8 h ， 通过3 0 0 0 r ／mi n离心 1 0mi n ， PBS洗涤2次， 用pH7．2的0.0 1 mo l ／L  PBS 制成 1×10¹⁰  ～2×10¹⁰ 细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀， 立即观察凝集现象。 同时，设立细菌悬液对照及血清对照。 

1.4.6 动物致病性试验

1.4.6.1小白鼠感染试验用5只2 0 g 左右重的小白鼠腹腔接种分离菌血清肉汤培养物0.2   mL ( 2×10⁷ C F U／ mL ) ，另设5只分别腹腔注射0.2 mL血清肉汤作对照。对注射后的小白鼠隔离饲养，观察其发病及死亡情况，对死亡的立即解剖，无菌采取肝脏、脾脏病料，涂片，革兰氏染色，镜检。并在鲜血琼脂平板上划线分离培养。 

1.4.6.2动物回归试验   30日龄断奶仔猪6只，分成两组， 一组腹腔注射2 mL分离菌( 含2×1 0⁷ C F U／m L)血清肉汤培养物。另一组腹腔注射2 mL无菌血清肉汤作对照。观察仔猪发病及死亡情况，对死亡的立即解剖，观察其病理变化。无菌采取肝脏、脾脏病料，涂片， 革兰氏染色，镜检。并在鲜血琼脂平板上划线分离培养。 

1.5纸片扩散法药敏试验

将纯菌株接种到马丁琼脂斜面， 37℃培养 18～24 h 后用灭菌生理盐水洗下，并稀释菌液使其含菌数为 1.5× 10 ⁶ 个／mL 。用灭菌棉拭子挑取菌液在琼脂平板上向一个方向均匀涂布，然后将平板每转动 6 0。涂布 1次，共涂3次，最后沿平板边缘涂布一圈。加盖后放置5 mi n ， 待平板稍干后用镊子将药敏纸片平放在平板上，并轻压使其紧贴平板表面。 每个平板贴 4张药敏纸片， 两纸片相距25 mm， 纸片与平板边缘不小于15 mm， 贴好纸片的平板于3 7℃培养1 8 h后观察结果。  

2 结果

2.1细菌鉴定

2.1.1 细菌分离结果从病死猪肺脏、心血、肝脏、肠系膜淋巴结均分离到一株具有α溶血的纯细菌培养物。 

2.1.2形态结构及染色性 分离菌为革兰氏阳性，菌体呈圆形，多呈双球形或短链状，液体培养物中链较长， 一般由8～ 15个球菌排成链状，无鞭毛，无芽胞，不运动，无荚膜，无粘液层，无两极着色现象。

2.1.3培养特性  分离菌为兼性厌氧菌，无运动性：在普通营养琼脂平板上生长极贫瘠，培养2 4 h后仅在划线处见有针尖大小的菌落；血清肉汤中血清肉汤浑浊，不形成菌膜，培养48 h后上清较透明，底部有颗粒状沉淀。在血琼脂平板上生长好， 37℃、2 4 h 即能长出灰白色、圆形、透明、闪光、中央隆起、表面光滑露珠状小菌落，菌落周围呈α溶血：在麦康凯琼脂平板上不生长。 

2.1.4生化试验结果( 见表 1 ) 表中表明分离细菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。 

表 1 分离菌生化试验结果

 

2.1.5血清学试验 将细菌悬液与 I ／I I 及 I I 型抗血清混合， 立即可见明显的凝集现象，但不与 I型 及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。 阴性对照均未见凝集现象。 

2.1.6致病性试验

2.1.6.1 分离菌对小白鼠致病性  小白鼠于感染后5 h开始死亡，至15 h全部死亡。死后解剖可见肝、脾、肾肿大，胸腔积液，用心血及胸积液涂片革兰氏染色镜检，发现有大量单个、 成对或4～2 0个左右的短链革兰氏阳性球菌。对照组小白鼠未见异常。 

2.1.6.2动物回归试验  腹腔感染仔猪于接种后24 h开始死亡，至48 h全部死亡。 剖检，空肠、回肠严重充血、出血 ，心肌、肺脏出血，胸腔积液，积液涂片革兰氏染色镜检，可见大量单个成对或成长链的革兰氏阳性球菌。对照组仔猪表现正常。通过以上鉴定，确定此菌为猪链球菌I I 型。 

2.2药敏试验

分离菌株对万古霉素、氨苄西林、头孢拉定、利福平、罗红霉素高度敏感，对青霉素钾、 氨苄青霉素中度敏感，对链霉素、庆大霉素、红霉素、复方新诺明、 环丙沙星、克林霉素不敏感。 

2.3疾病控制

采取饲养环境和饲料消毒、发病猪隔离、氨苄西林和利福平配合治疗等措施，有效地控制了疫情，未发生人的感染。  

3 讨论

3.1鉴于 I I 型猪链球菌感染不仅造成大量猪的死亡， 也因可引起急性高死亡率的人STSS 和SMS 而颇受关注。为了能及时发现并控制猪群中I I 型猪链球菌感染，疑似病、死猪标本中的I I 型猪链球菌分离及鉴定是至关重要的病原学依据。实验结果表明，在分离菌落的基础上，采用猪链球菌 I I 型诊断血清的玻片凝集试验能快速鉴定猪链球菌，且具有简便、 廉价、 准确等优点。

3.2从理论上讲，猪链球菌的抵抗力不强，治疗上很多药物都应有效，但从药敏试验及临床治疗来看，常用药物的敏感性很低，多表现耐药，所分离病原菌表现多重耐药性，这与本实验室 2 0 0 1 年在同一地区所做的同一试验结果存在着较大差异，这主要与滥用药物及用药习惯有关。 因此，对于链球菌病的治疗早期可采用2～ 3 种药物试验性治疗，最好在药敏试验基础上合理用药。使用药物预防时应避免长期使用同一种药物， 可几种药物交替使用。

3.3 近几年来，在我国部分省、市爆发流行猪链球菌 I I 型，对人的健康造成了严重危害。因此，饲养员、兽医、管理人员以及屠宰场工人等接触病猪、剖检死亡猪和处理污染物时要特别注意自身的防护，防止被感染。