应用不同培养基检测单增李斯特菌结果比较

    据中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所的报告显示，单核细胞增生李斯特菌 ( Listeria monocytogenes，单增李斯特菌) 已经成为2 1世纪可能对中国人卫生健康有重大影响的病原微生物之一。该菌广泛分布于环境中，由该菌引起的污染是一个典型的环境卫生问题。 

    世界卫生组织关于单增李斯特菌食品中毒的报告中指出，4％-8％的水产品、5%-10％的乳及乳制品、30％以上的家禽均被该菌污染。由于该菌在4 ~ C冰箱保存的食品中也能生长繁殖，使其危害性更进一步增大。据报道，约85％-90％的病例是由被污染的食品引起的。为此，各国均建立了单增李斯特菌标准检测方法和快速检测方法，显色培养基作为快速方法中的一种，已经越来越多地被运用。法国A ES  Laboratoire 和 CHROMagar 公司已有商品化的培养基，并得到了诸如FDA 、ISO等标准化组织的正式批准。本实验观察上述2种显色培养基与传统方法比较，样品中单增李斯特菌的菌落特征以及快速检测的敏感性和特异性。 

 

1 材料与方法

1.1材料

 

1.1.1菌株来源 标准菌株( 英诺克李斯特菌) 由本中心菌种保藏室提供； 试验菌株来自食品检测样品，主要包括：奶制品、肉制品、海鲜类产品和蔬菜，共计2 6 8份。 

 

1.1.2培养基 传统培养基 MMA、 OXA由本中心培养基室制备。显色培养基ALOA出自法国A E S  L a b o r a t o i r e 公司， C H R O M a g a r   L i s t e r i a出自法国 C H R O Ma g a r 公司。所有培养基均在有效期内配制并使用。 

 

1.2方 法

 

1.2.1标准菌株 取标准菌株酪胨大豆酵母浸膏肉汤( T S B—Y E) 培养物，分别划线接种于 M MA 、O X A、A L O A和C H R O Ma g a r  L i s t e r i a 培养基平板上，3 5℃培养2 4-4 8 h ，观察菌落生长特征。 

 

1.2.2检测样品   每份样品取2 5 g ( 或2 5 m L ) ， 加入225 m L 改良缓冲蛋白胨 ( M B P) ， 固状样品高速均质1-2 m i n ，充分振摇制成1 ：1 0样 品， 3 0℃培养 1 8—2 4 h 。  移取1 m L ， 转种于 1 0 0 m L增菌培养液( E B ) 中， 3 0℃培养2 4 h和 4 8 h 。分别取增菌液一环 ， 划线接种于 MM A、 O X A、 A L O A 和 C H R O M a g a r   L i s t e r i a培养基平板上， 予 35℃培养2 4-48 h 。挑取可疑菌落， 划线接种到胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂( T S A— Y E ) ， 置于3 5℃纯培养 2 4 h ； 另转种于 T S B—Y E置于3 5 ℃纯培养 2 4 h ， 进行鉴定实验。最后， 以A P I —L i s t e r i a 板条和 B溶血试验作最终确认。 

 

2 结果

 

2.1菌落特征

李斯特菌属细菌( L i s t e r i a  s p p ． ) 与单增李斯特菌在M MA和OX A上很难区分， 而在 C H R O Ma g a r   L i s t e r i a和A L O A上由于 L i s t e r i a   s p p ． 缺少明显的晕圈，很容易与单增李斯特菌区分开来。A L O A上单增李斯特菌的菌落特征较为明显，C HRO Ma g a r   L i s t e r i a上细菌大小差异较大，较大菌落边缘粗糙，不透明晕圈也没有 A L O A上的明显( 见表 1 ) 。 

 

表1   单增李斯特菌及李斯特菌标准菌株在不同培养基上的菌落特征

 

2.2 鉴定情况

由于显色培养基上单增李斯特菌有明显的不透明晕圈， 故在C HRO Ma g a r  L i s t e r i a和 A L O A上检 出的 L i s t e r i a s p p ． 不包括单增李斯特菌，可疑菌落最终被确定为单增李斯特菌的概率为 97.8％和 100.0％， 而 MMA和 OXA 分别 只 有 27.9％ ( 3 9／1 4 0)和 28.5％ ( 4 5／1 5 8) 。 C H R O M a g a r   L i s t e r i a 培养基上有 1例单增李斯特菌的可疑菌落最终被排除 ， 经确认为绵羊李斯特菌( 见表 2 ) 。 

 

表 2 单增李斯特菌可疑菌落在不同培养基中的鉴定情况

 

    在268 件食品样品中检出单增李斯特菌45件，检出率为16.8 ％。A L O A和 O X A均检出了这45件单增李斯特菌；HROMa g a r  L i s t e r i a检出4 4件， MMA检出 39件 ( 见表3 ) 。显色培养基与传统培养基的结果有良好的一致性(  χ²= 0.09 ， P> 0.05) 。除了单增李斯特菌以外的 L i s te r i a   s p p ． 中， 英诺克李斯特菌的污染率较高， 在MMAOX A、 CHROMag a r   L i s t e r i a和 AL OA上分别 占 100.0％( 1 0 1／1 0 1 )、 98.2％ (1 1 1 ／ 1 1 3 ) 、 86.7％ ( 1 3 ／ 1 5) 和 95.2 ％( 2 0／2 1 ) 。 

 

表 3     2 6 8件样品在不同培养基检出李斯特菌的结果 比较

*：因大部分样品的试验周期较长( 一般超过 3个月) ， 故单增李斯特菌的污染率较高

 

3 讨论

     传统培养基检出单增李斯特菌一般需要 5～7 d ，而使用显色培养基一般只需要4 d ， 阴性样品( 无菌落生长)2d就可以排除。传统培养基只能确定可疑菌落为李斯特菌属， 然后再通过一定的生化试验检出单增李斯特菌。这个过程使检测周期延长，且增加了实验的花费。而显色培养基可直接从视觉上判读，克服了上述的缺点。 

     OX A是以水解七叶苷为主要反应，李斯特菌属大多能水解七叶苷，故传统培养基不能很好地区分单增李斯特菌和其他种。C H R O Ma g a r   L i s t e r i a的作用原理是其含有D L一丙氨酸 一1 3一萘胺和 D一丙氨酸 一对硝基苯胺2种底物， 除了单增李斯特菌以外的其他李斯特菌属细菌均含有分解这2种底物的酶， 因此可快速鉴别单增李斯特菌和其他李斯特菌。A L O A则是利用单增李斯特菌所特有的磷脂酶作用于相应的底物，使之释放出显色基团，从而区分单增李斯特菌和其他种。

英诺克李斯特菌是一种对人体非致病的李斯特菌，在显色培养基上可以较好地区分它和单增李斯特菌。C H R O M a g a r   L i s t e r i a上 单增李斯特菌伴有白色晕圈；A L O A上单增李斯特菌菌落周围也有一明显的不透明晕圈，而英诺克李斯特菌则没有相应的晕圈。C H R O Ma g a r L i s t e r i a上英诺克李斯特菌检出1 3件( 86.7 ％) ， 在 AL O A上为20件( 95.2 ％) 。而在 MMA上检出 1 0 1件， OXA上检出1 1 1件 ， 分别占可疑样品数的7 2.1％( 1 0 1／1 4 0) 和70.3％( 1 1 1 ／1 5 8 ) ， 构成了可疑样品数的主要部分。显色培养基上英诺克李斯特菌可以直接与单增李斯特菌相区分，故单增李斯特菌的检出率大大提高。在M M A 和OX A上难 以与单增李斯特菌相区分，需进行进一步的生化试验加以区别。加之所占比例较高，所以对单增李斯特菌检出造成一定的困难。虽然 OX A最终也将4 5件单增李斯特菌检出， 但比起显色培养基增加了相当的工作量和检测周期。英诺克李斯特菌在选择性增菌肉汤中的生长对单增李斯特菌会产生一定的影响，因其会产生一种类似抗生素的物质来抑制单增李斯特菌的生长，故在肉汤中处于生长的相对优势，从而对单增李斯特菌的检出会起到一定的反作用。由于在显色培养基上单增李斯特菌能很好被区分开来，可以较大程度地避免常规方法中用溶血试验来区分单增李斯特菌和英诺克李斯特菌。 由于溶血试验的结果判读受主观因素影响较大，因此会对结果产生一定的影响。

    在C H R O M a g a r   L i s t e r i a 上绵羊李斯特菌表现出与单增李斯特菌相同的菌落形态，故无法从视觉上区分这 2 种细菌。但绵羊李斯特菌在环境中出现的概率非常低，对 C H R O Ma g a r   L i s t e r i a 上可疑菌落检出单增李斯特菌不会造成太大的影响。