突变与育种

一、自发突变与育种

1 ．从生产中选育 在日常的大生产过程中，微生物也会以一定频率发生自发突变。富于实际经验和善于细致观察的人们就可以及时抓住这类良机来选育优良的生产菌种。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的自发突变株。

2 ．定向培育优良品种 是指在某一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累其自发突变，并最终获得优良菌株的过程。由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，故用此法育种十分缓慢。例如，当今世界上应用最广的预防结核病制剂——卡介苗 (BCG vaccine) 的获得，便是定向育种的结果。这是法国科学家 Calmette 和 C ． Guerin 经历了 l3 年时间，把牛型结核分支杆菌接在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续转接了 230 代，才在 1923 年成功地获得了这种减毒的活菌苗 -- 卡介苗。

二、诱变育种

    诱变育种是通过人工方法处理微生物，使之发生突变，并运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的优良菌株选育出来的过程。人工诱变与自发突变相比可大大提高微生物的突变率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变株，作生产和研究之用。

（一）诱变育种的基本环节

    诱变育种的具体操作环节很多，且常因工作目的、育种对象和操作者的安排而有所差异，但其中最基本的环节却是相同的。

( 二 ) 一般性原则

1 ．挑选优良的出发菌株

    出发菌株是指用于育种的起始菌株。有利性状：高产、生长速度快、营养要求粗放、产孢子早而多的菌株等。

2 ．选择简便有效的诱变剂

    在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而化学诱变剂中，以 NTG 最为有效。

3 ．处理单孢子（细胞）菌悬液

    在诱变育种中，所处理的细胞必须是单孢子或单细胞悬液状态。其目的是：一方面分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂；另一方面又可避免长出不纯菌落。在某些微生物中，即使用这种单细胞悬液来处理，还是很容易出现不纯菌落，这是由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的原故。

4 ．选用最适剂量

    各种诱变剂有不同的剂量表示方式。剂量一般指强度与作用时间的乘积。化学诱变剂常以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。

    由于诱变剂是用来提高突变率、扩大产量变异的幅度和使产量变异向正突变的方向移动，因此，凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。

5 ．充分利用复合处理的协同效应

6 ．设计或采用高效筛选方案或方法

①筛选方案：在实际工作中，一般认为应采用把筛选过程分为初筛与复筛两个阶段的筛选方案为好。前者以量（选留菌株的数量）为主，后者以质（测定数据的精确度）为主。

②筛选方法：初筛可在平板上进行，也可在摇瓶中进行，两者各有利弊，复筛必须在摇瓶中进行，并作精确测定。

( 三 ) 营养缺陷型的筛选

1 ．营养缺陷型

    营养缺陷型 (auxotroph) 某一野生型菌株由于发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。

    野生型（ wild type ）：从自然界分离到的任何微生物在其发生营养缺陷型突变前的原始菌株。

    原养型 (prototroph) ：一般指营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。

    基本培养基 (MM) 能够满足野生型菌株生长最低限度需要的培养基。

    补充培养基 (SM) 凡能满足相应的营养缺陷型生长需要的培养基。。在 MM 中加蛋白胨（多种氨基酸 ) 便可以用来培养各种氨基酸的缺陷型；加入酵母浸膏 ( 其中含有多种 B 族维生素和核苷酸 ) 便可以培养不同的维生素、嘌呤和嘧啶缺陷型。

    完全培养基 (CM) 凡能满足一切营养缺陷型生长需要的培养基。

2 ．筛选过程

    筛选营养缺陷型突变株一般经过诱变处理、淘汰野生型、检出营养缺陷型、营养缺陷型鉴定等步骤，最终筛选出营养缺陷型。

    淘汰野生型 即浓缩缺陷型。中间培养后的细胞中除营养缺陷型菌株外，仍含有大量野生型菌株，为便于筛选，须将野生型细胞大量淘汰以浓缩营养缺陷型细胞，常用抗生素法和过滤法。前者的基本原理是野生型细胞能在基本培养基上生长繁殖，可选用某种抗生素将生长状态的细胞杀死，而留下不能生长的缺陷型细胞。

    过滤法是使能在基本培养基上生长形成菌丝体的野生型留在滤膜上，不能生长的营养缺陷型孢子则能透过滤膜。

    由此可见，缺陷型能否被浓缩，关键是细胞在 MM 中能否生长。为了准确地表现性状，必须使细胞在浓缩前耗尽体内或体表的营养，故需用 MM 洗涤，然后再用 MM 加抗生素培养。

    营养缺陷型的检出 浓缩后得到的营养缺陷型比例虽加大，但不是每株都是营养缺陷型，还需进一步分离，常用的方法有：、

①逐个检出法 把浓缩的菌液 ( 细胞或孢子 ) 在完全培养基上进行分离培养，然后将平板上出现的菌落逐个地点种到基本培养基和完全培养基上，经过一定时间培养后，凡是在基本培养基上不能生长，而在完全培养基上能生长的菌落，经重新复证后仍然如此，则这样的菌落便是营养缺陷型。

②夹层检出法 在培养皿底层倒入一层基本培养基，待凝后，在其上倒入一层稀释菌液与基本培养基的混合物，凝后再倒人一层基本培养基，培养后长出的菌落为野生型，其上再加上一层完全培养基，经过培养后新出现的菌落则多数是营养缺陷型。这种方法一般适用于细菌。

③限量补充培养基检出法 将经过浓缩的菌液接种在含有微量 (0.6 ％或更少 ) 蛋白陈的 MM 培养基上培养，野生型迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型生长较慢，故长成小菌落而得以检出。

④影印法 将已灭菌的丝绒布，包在直径小于培养皿的小圆柱体上，这样便制成了一个印章，它可使菌落位置不变地从一个培养皿移至另一个培养皿。具体操作方法是：把印章放在已长出菌落的平皿 ( 完全培养基 ) 上轻轻压一下 ( 注意不要沾上培养基 ) ，然后轻轻地分别印在基本培养基和完全培养基上，培养后，在完全培养基上生长，而在基本培养基上不生长的菌落便是营养缺陷型。因霉菌孢子容易飞散，故常引起误差。影印法是在细菌抗药性变异研究中发展起来的技术，目前已在放线菌、酵母菌等形成小菌落的微生物育种中广泛应用。

    营养缺陷型鉴定 营养缺陷型的种类很多，选出后需要鉴定。常用生长谱法，即是在基本培养基中加入某种物质时，能生长的菌便是某种物质的缺陷型。其步骤是，首先鉴定需要那一类生长因子，可用天然产物的混合物检测，其次鉴定具体因子。

    缺陷营养类别的确定 常用于确定营养缺陷型类别的天然混合物有：不含维生素的酪素水解物、氨基酸混合物或蛋白陈；水溶性维生素混合物； O.1 ％碱水解酵母核酸液等。检测方法可用滤纸法。取 0.5cm 直径的滤纸片沾取以上溶液，放在已接菌的平皿上培养，只要在此滤片周围能长出菌，即可说明此营养缺陷型的类别。

    缺陷营养因子的确定 缺陷盼营养因子可能是一种，有时会是二、三种或更多。检测可用上述滤纸法，亦可用营养组分分组法，例如，在分析 l 5 种可能的营养因子时，可按表的组合配成 5 种溶液。将组合营养因子的纸片放置于 MM 培养基上，观察生长情况，便可根据表的营养因子缺陷示意表查出其营养缺陷因子，通过单一因子复证以确定。

营养因子的组合及其缺陷示意表