单胞菌（monad）的人工感染与分离

实验目的

熟悉单胞菌的形态特征及培养特点，鱼类病原菌分离鉴定的基本方法，巩固单胞菌所致鱼病的基本特性及症状。

实验材料

单胞菌株纯培养物 普通琼脂平板 鲜血琼脂平板 普通肉汤 无菌蒸馏水 解剖刀 剪刀 镊子 纱布 白瓷盘 洁净的玻片 平皿 光学显微镜 一次性注射器 针头 记号笔 酒精棉球 饵料 玻璃注射器 水族箱 气泵 控温仪 吸管 洗耳球 灭菌试管 实验用鲫鱼 生理盐水 温度计 捞网

实验操作程序

1 ．单胞菌株的纯培养

[ 培养基 ]

（ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。

牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g

蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml

氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6

初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。

（ 2 ）普通营养琼脂培养基

普通肉汤 1000ml

琼脂 20g

琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。

将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。

加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内， 121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定坡度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。

盐水瓶中的普通琼脂已手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～ 60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。

培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。
（ 3 ）鲜血琼脂培养基

将灭菌的普通琼脂培养基冷却至 50 ℃ 左右，加入无菌的绵羊或家兔脱纤鲜血达 5 ％（即每 100 ml 普通琼脂加入鲜血 5 ～ 6 ml ），混合后，分装灭菌试管立即摆成斜面或倾注于平皿内（如果琼脂温度过高，鲜血加入后则成紫褐色，温度过低，则鲜血加入琼脂易凝不易混合。注意，混合时切勿产生气泡）待凝固后，置 37℃ 培养 24h ，无菌检验合格方可应用。

无菌血液是用无菌操作方法采自健康动物，通常是绵羊或家兔的血液，加到盛有 5 ％灭菌枸橼酸钠或 3 ％灭菌肝素的 100 ml 三角瓶内，或加到盛有玻璃小珠的灭菌三角瓶内摇动脱纤后置冰箱中待用。

[ 细菌培养 ]

取实验斜面或平板上的单胞菌株，于普通平板或鲜血平板上分区划线，以得单菌落，观察普通平板和鲜血平板上细菌的生长表现，观察的主要内容有：

（ 1 ）大小：其大小以 mm 表示，微小菌落：针尖大，直径小于 0 . 5mm ，如支原体菌落、猪丹毒杆菌菌落；小菌落：直径在 0 . 5 ～ 1 mm 之间，如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落；中等大小的菌落：直径在 1 ～ 3 mm 之间，如巴氏杆菌、沙门氏杆菌菌落；大的菌落：直径大于 3mm ，如炭疽芽孢杆菌菌落等。

（ 2 ）形态：圆形，不规则形（根状、树叶状）

（ 3 ）边缘：整齐，不整齐（锯齿状、虫蚀状、卷发状）

（ 4 ）表面：光滑、粘液状、粗糙、荷包蛋状、漩涡状、颗粒状

（ 5 ）隆起度：隆起，轻度隆起，中央隆起，平升状、扁平状，脐状（凹陷状）

（ 6 ）颜色：无色、灰白色、白色、金黄色、红色、粉红色

（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明

（ 8 ）溶血性： β －溶血（完全溶血）， α －溶血（不完全溶血），不溶血

挑单菌落接种于普通琼脂平板 28 ℃ ， 24 h 培养或接种于盛肉汤的三角烧瓶中， 150 rpm ， 28℃ ， 18 － 24 h 振荡培养。注意观察培养物的浑浊度（轻度浑浊、中度浑浊、浑浊）、沉淀物的性状（颗粒状、絮状、粘稠状）、培养基表面是否形成菌膜、菌环以及培养物的颜色等。

2 ．菌液稀释

三角烧瓶中的液体培养物用生理盐水直接倍比稀释至适当的浓度，平板上的细菌用涂布棒刮下并用生理盐水冲洗掉，稀释到一定浓度，并用紫外分光光度计或麦氏比浊管法检测（事先可确定一条比色浓度与细菌含量之间的关系曲线）。

3 ．细菌接种

试验鱼人工感染的接种方法目前最常用的有浸泡、口服、注射、涂抹等，究竟选用哪一种方法最合适，需要根据不同的疾病类型和可能的侵入途径而定。如体表的病，可采用浸泡法：是体内的病，可采用口服、注射等。接种动物的细菌用量是个问题。接种量过大，即使该菌为非病原菌，可能会因大量菌体裂解释放的大量内毒素致死动物，并无细菌繁殖致病的过程。问题的关键是要测定所分离的细菌对接种动物的半数致死量（ LD 50 ），根据 LD 50 的大小来判断其致病力的强弱，进而判断其是否为病原菌。这也适用于区分同种细菌不同菌株致病力的差异。一般的接种剂量为 50LD 50 。

本实验采用注射的方法。实验鱼在实验前需进行 1 ～ 2 周的暂养。每组实验用鲫鱼 10 尾，每尾肌肉或腹腔接种 0 . 1 ～ 0 . 5ml 稀释后的肉汤培养物，置盛有水的水族箱内，用控温仪使温度维持在 28 ～ 30 ℃ 左右。定时投饵和换水，同时设接种无菌生理盐水的对照组。

4 ．观察记录

观察接毒鲫鱼的发病症状及死亡情况，并做好记录。

5 ．细菌分离

对濒临死亡或刚死不久的鲫鱼进行病原菌的分离。

鱼体表： 取病灶部分小片或用接种环刮取病灶部位，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板（鲜血）上划线分离。

内部组织器官： 用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，用剪刀在火焰上烧灼灭菌，再在组织上烫之，杀死表面的杂菌，随即在烧灼部刺一小孔。用灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒），伸向烧灼部小洞中，用手指将接种环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。左手持握普通（鲜血）琼脂平板（平皿盖留在桌上），使之尽量垂直，以免空气中杂菌落入，并靠近火焰，右手持带有细菌材料的接种环在穷汉字平板上分区划线。划线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注明接种材料、日期及操作者代号。也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块，用镊子夹住病科使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，染色后在显微镜下直接镜检，能快速获得结果。

鳃部： 用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。

血液及体液： 用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布或划线及肉汤内，分离细菌。

实验操作步骤

（一）致病菌的培养和实验前的准备工作

1 ．实验鱼的驯养

1 ）实验材料：养鱼的塑料箱，异育银鲫，控温加温棒，充气泵，气管，气头，温度表

2 ）实验方法：实验用的健康异育银鲫，在加网罩的塑料箱中驯养约一个星期，充气增氧，在驯养期间水温逐渐升高，每天温度升高 2 ～ 4℃ ，最终保持在 28 ～ 30℃ 左右。及时吸污和换水，保持水质清新。

2 ．致病菌（嗜水气单胞菌）的扩大培养

1 ）实验材料：营养琼脂培养基斜面（每组 2 支），接种环（ 1 支），嗜水气单胞菌斜面菌种（ 1 支）。

2 ）实验方法：按微生物学实验方法把菌种接种到营养琼脂培养基斜面上，放在 28℃ 培养箱中培养 24h 小时候备用。

3 ．营养琼脂培养基平板

1 ）实验材料：灭菌空培养皿（每组 4 只）， 250ml 三角烧瓶（每组 2 只）， 100ml 量筒（ 1 只），天平（ 1 台），营养琼脂培养基，称量纸，搅拌玻璃棒。

2 ）实验方法：称取 4.1 克 营养琼脂培养基，倒入三角烧瓶中，加入用量筒量取的 100ml 蒸馏水，用玻璃棒搅拌稀释后，用棉塞塞住三角烧瓶，待灭菌，灭菌后温度下降至 40 ～ 50℃ 时倒平板。

4 ．致病菌感染和分离时所用器械灭菌

1 ）实验材料：剪刀（每组 3 把），镊子（每组 3 把），注射器（每组 3 只），针头（每组 5 只），滴管（每组 3 个），铝盒（每组 1 个）。

2 ）实验方法：洗净所有的器械装入铝盒中灭菌，备用。

（二）致病菌的人工感染

1) 实验材料：嗜水气单胞菌斜面（每组 2 支），试管架（ 1 个）酒精棉球（ 1 瓶），无菌生理盐水，灭菌空试管，麦氏比浊管。

2 ）实验方法：用装有针头的注射器（或无菌吸管），吸取无菌生理盐水，滴注到培养有嗜水气单胞菌的斜面上，振荡使斜面上的菌落洗下（或用灭菌接种环轻轻刮下），倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到 2.1×10 9 个细菌 /ml （ 21 亿），用灭菌注射器抽取菌悬液，待人工感染时用。注射部位在鱼的背鳍前端与侧线之间的中部区域。用酒精棉球在注射部位擦拭进行体表消毒后进行肌肉注射。针尖斜向鱼的头部，与鱼体成 30° 左右的角度插入肌肉，注射深度在 1 ～ 1.5 cm 。每尾鱼注射量为 0.6 ml ，每天观察鱼的发病及症状等情况并做好记录。

（三）致病菌分离

1 ．实验材料：灭菌的剪刀（每组 3 把），镊子（每组 3 把），解剖刀，接种环，营养琼脂培养基平板（ 4 只）。

2 ．实验方法：将具有症状的活鱼或刚死的鱼，放在瓷盘中，用拧干的酒精棉球在病鱼体表进行消毒，用剪刀从靠近肛门的地方向上剪开再沿侧线向前剪开，至鳃腔后缘，向下剪至胸鳍基部。用无菌镊子揭开腹壁，暴露腹腔。解剖刀上的刀片在火焰上烧灼后，迅速压印在鱼的肝（或肾）表面灭菌，再用烧灼后的接种环在肝（或肾）地灭菌处插入脏器内，旋转 1 ～ 2 圈后抽出，在营养琼脂平板上进行划线分离，作好标记（时间、脏器名称），放在 28℃ 培养箱中培养 24 h 后观察菌落形态特征，在占比例高的菌落形态一致的菌落中挑选一个菌落，用接种环挑起接种到斜面，作为致病菌株的候选对象。（分离出的菌株再进行人工感染，观察是否发病及病症是否与该病病鱼症状一致，如一致，分离的该菌株为致病菌，再次人工感染实验省略）。

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