细菌检验工作的基本技术——弧菌属

虽然弧菌属内包含的菌种较多，但临床实验室常见到12个菌种，其中具有明确致病作用的有霍乱弧菌、副溶血弧菌、河弧菌、拟态弧菌等。

弧菌的鉴定分两步，首先应与相近的菌属区别，定属后再做种的鉴定。

    1. 与相似的菌属区别：弧菌属归弧菌科。同科中还有气单胞菌属和邻单胞菌属，均为氧化酶阳性，发酵型。弧菌属与其两者的区别可依嗜盐性、甘露醇、氨基酸及Ο/129(2,4-二氨基-6,7-二异丙基碟啶)敏感性等加以区别，Ο/129试验用纸片浓度10μg、150μg二种，与纸片法药敏试验相同，出现抑菌环即判阳性(S)。

2．霍乱弧菌的鉴定：目前我国临床细菌室对霍乱弧菌的鉴定一般只作初步鉴定，具体方法如下：

(1)直接涂片

悬滴检查：取患者粪便制成悬滴标本(亦可用压滴法)，检查细菌的动力。霍乱弧菌无论是古典生物型或El-tor生物型均呈现极活泼的穿梭状运动。Ο1群霍乱多价血清制动试验阳性，可作早期推测性报告。

表5-3-37           致病弧菌的生化特性(阳性百分率)

 

染色检查：取米泔样粪便的絮状物、粘液部分涂片2张，干燥后用乙醇固定，分别用革兰染色及1:10稀释的石炭酸复红染色，干燥后用油镜检查，观察有无革兰阴性、呈鱼群样排列的弧菌。涂片检查，只能对可疑患者作初步诊断参考，不能作确诊依据。

(2)玻片凝集试验：自分离平板上挑取可疑菌与霍乱多价诊断血清(即Ο1群霍乱多价血清)做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～l：160之间，如过浓，则稀释后再作凝集。将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混于血清内，即刻(一般不超过 10s)出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。菌落应以生理盐水作对照，对照应不发生凝集。为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集试验。作初步鉴定试验后，将此高度疑似菌送卫生防疫站作最后鉴定。

霍乱弧菌是重要病原菌。由于病原学及流行病学方面的需要，对Ο1群霍乱弧菌进一步分型是必要的。国际上公认通用的区分方法有两种：①生物分型；②抗原分型。

生物分型：根据霍乱弧菌在生物学上的差异，分为两个生物型，命名为古典生物型和 El-tor生物型。古典生物型的毒力往往大于 El-tor生物型。古典生物型菌株的染色体上带有两个毒素基因，而绝大多数El-tor生物型菌株仅有一个毒素基因。在霍乱病的防治中，对菌株进行生物分型是必要的。

两种生物型的区分方法见表5-3-38。

     表5-3-38                 霍乱弧菌的生物分型

 

抗原分型：霍乱弧菌的血清学分型是依据菌体抗原。古典生物型和El-tor生物型的抗原同属Ο1群霍乱弧菌。

Ο1群的霍乱弧菌还可以进一步分血清型。依菌株是否具备A、B因子，分为小川、稻叶、彦岛3个型别，血清分型见表5—3—39。

表5-3-39       霍乱弧菌生物分型和血清型

 

根据以上分型原理，鉴定致病性霍乱弧菌应遵循以下3个步骤：

    ① 可疑菌落与Ο1群抗血清凝集，确定是属于Ο1群，还是非Ο1群弧菌。

    ② 与分型血清A、B凝集，确定血清型。

③ 作生化试验进行生物分型，确定是古典生物型，还是El-tor生物型。

 

3．其他弧菌的鉴定：弧菌属中除Ο1群霍乱弧菌多次暴发世界性流行霍乱病，非Ο1群中的Ο139群最近报告暴发霍乱流行。其他弧菌种，不仅与腹泻有关，尚可引起肠外感染。分离出上述菌株应予以鉴定。本菌属中致病的12个菌种其生物学特性参照表5—3—37所列及表5—3—40分群鉴定。表5-3-40       弧菌属的分群鉴定

 

鉴定中用0％NaCI生长、氧化酶、硝酸盐、氨基酸及发酵肌醇等几个试验将上述12个菌种分成6个群。分群后，仅1群、5群和6群还需要继续区分。

霍乱弧菌与拟态弧菌的区别方法可以用蔗糖发酵试验，前者阳性而后者阴性(表5—3—37)。

第5群3个菌种的区别可依据甘露醇发酵和葡萄糖产气试验，3种细菌的反应特征见表5—3—37。

第6群的4个菌种的区别可依据水杨苷和蔗糖发酵试验，4种细菌的反应特征见表5—3—37。

1992年10月发生在印度南方泰米尔纳依邦(Tamilmadu)的Madas，分离到与Ο1群霍乱弧菌无关、命名为Ο139型霍乱弧菌，该菌的生物学特性符合霍乱弧菌，用Ο1群霍乱弧菌抗血清不能制动，绵羊RBC溶血反应不定，抗多粘菌素B(50U)和复方新诺明，抗Ο/129，对MukherjeeⅣ和V型噬菌体不敏感。血清学鉴定参照卫生部生物制品检定所生产Ο139霍乱弧菌诊断用试剂盒说明书。

见肠杆菌科鉴定，其中氨基酸脱羧酶试验培养基中必需含1％氯化钠。

Ο/129敏感试验：用含0.5％NaCl M-H琼脂，如纸片法药敏试验相同接种被检菌株，贴上含Ο/129 10μg／片、150μg／片，35℃孵育18h，记录结果：