二、试验方法（2010.07.14-2）
(一)硝酸盐还原试验
培养基：
蛋白胨 1g
硝酸钾 0.1g
蒸馏水 l00ml
将上述成分溶于蒸馏水，校正pH为7.4～ 7.6，分装，高压灭菌121℃15min，冷却后备用。
试剂：
A液：
对氨基苯磺酸 0.8g
5N醋酸 100ml
B液：
α-萘胺 0.5g
5N醋酸 l00ml
方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。
结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。
注意点：
1．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。
2．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。
(二)甲基红试验
培养基：
葡萄糖 0.5g
多价蛋白胨 0.5g
磷酸氢二钾 0.5g
蒸馏水 100ml
将上述成分溶于蒸馏水，校更pH为 7.2，分装，高压灭菌121℃10min，冷却备用。
试剂：甲基红 0.1g溶于95％乙醇 300ml，然后加蒸馏水至500ml。
方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。
结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。
(三)MIU培养基(动力-靛基质-尿素)
培养基：
胰蛋白胨 1g
NaCl 0.75g
磷酸氢二钾 0.2g
葡萄糖 0.1g
琼脂 0.4g
蒸馏水 l00ml
0.4％酚红 适量
20％尿素 10ml
将上述成分(尿素除外)溶于蒸馏水，加适量0.4％酚红，高压灭菌116℃20min，20％尿素过滤除菌，加入灭菌后的培养基中，分装、备用。
方法：将待检菌穿刺接种于MIU培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果： 动力“十”，穿刺线周围扩散生长。
培养基变红为尿素阳性。
加靛基质试剂变红为吲哚阳性。
(四)拘橼酸盐试验(Simmons法)
培养基：
氯化钠 5g
硫酸镁 0.2g
磷酸二氢铵 1g
磷酸氢二钾 1g
枸橼酸钠 2g
蒸馏水 1000ml
0.2％溴麝香草酚蓝 40ml
将上述成分溶于蒸馏水，校正pH7.0，加溴麝香草酚蓝指示剂，高压灭菌121℃ 15min，分装，备用。
方法：将待检菌接种于培养基中，孵育过夜，观察结果。
结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。
(五)氨基酸脱羧试验
培养基：
蛋白胨 5g
酵母浸膏 3g
葡萄糖 1g
溴甲酚紫(1.6％溶液) lml
蒸馏水 1000ml
L—氨基酸 0.5％
将上述成分(除氨基酸外)溶于蒸馏水，然后加氨基酸，校正pH6.7～6.8，分装，高压灭菌121℃lOmin，备用。用于对照的不加氨基酸。
方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。
结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。对照管应保持黄色。
注意点：
1．培养基的pH值很重要。
2．加封石腊油造成厌氧环境。因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定。
3．对照管如不呈黄色，则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定。
(六)葡萄糖酸盐试验
培养基：
蛋白胨 1.5g
酵母浸膏 1g
磷酸氢二钾 1g
葡萄糖酸钾 40g
蒸馏水 1000ml
上述成分溶解、过滤，校值更pH6.5，分装每管lml，高压灭菌115℃15min，冷却，备用。
试剂：班氏试剂。
大量接种待检菌于培养基中，35℃孵育过夜或至48h，加班氏试剂，水浴中煮沸 lOmin观察结果。
结果：有黄色到橙色出现为“+”，没有颜色变化为“一”。
(七)糖、醇发酵试验
培养基：
蛋白胨 l0g
肉膏 3g
氯化钠 5g
Andrade指示剂 l0ml
蒸馏水 1000ml
将上述成分溶于蒸馏水，加糖或醇，校正 pH7.1～7.2，分装，高压灭菌121℃15min。冷却备用。
葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇的浓度为 1％。其他糖类和卫矛醇、水杨苷等的浓度为 0.5％。
乳糖、蔗糖和阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等二糖应过滤除菌，再加入于已灭菌的基础液中。
Andrade指示剂：
蒸馏水 l00ml
酸性复红 0.5g
lmol／L氢氧化钠 16ml
将复红溶解于蒸馏水，加入氢氧化钠，数小时后，如复红褪色不够，再加l～2ml氢氧化钠，使呈淡黄色。
方法：接种待检菌，35℃孵育过夜，观察。
结果：培养基变红色为阳性，不变色或黄色为阴性。
(八)苯丙氨酸脱氨试验
培养基：
DL-苯丙氨酸 2g (L-型1g)
酵母浸膏 3g
氯化钠 5g
磷酸氢二钠 1g
蒸馏水 1000ml
将上述成分溶于蒸馏水，分装，高压灭菌 121℃15min，冷却，备用。
试剂：10％三氯化铁溶液。
方法：将待检菌接种于培养基，35℃孵育过夜，加三氯化铁试剂，观察结果。
结果：培养基变绿色为阳性，不变色为阴性。
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