高生产率和高细胞密度发酵（下）

(三)诱导策略

      对于许多带有诱导型启动子的重组微生物，只有将生长期和产物形成期分开才能获得最大生产率。在流加培养中，这两段时期的分离可以通过延迟诱导直至细胞生长已达到高密度来实现。此外，如果质粒稳定并且产物对培养物无毒，那么可以用重复补料分批培养系统来提高生产率。有学者采用重复补料分批培养技术培养酿酒酵母，每24 h更换50%的培养基，持续30 d，其产物(hirudin)的产量可比连续培养系统提高3倍。

      如果诱导物和产物对细胞都有毒性，那么应当人为地将诱导期和生长期分开。对于这种情况，两级连续培养是最适宜的培养方式。控制第一罐的条件，使细胞生长处于最适状态之下，而诱导与产物形成则发生在第二罐中。例如，在恒化器中培养一株能产b-内酰胺酶的重组大肠杆菌，将第一罐的发酵液导入第二罐中，构成一个两级培养系统。第二罐中添加营养物以及IPTG作为诱导物。结果获得300 mg活性b-内酰胺酶(相当于总蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。这一系统至少可以稳定运行50 d。另一相似的系统被用于培养大肠杆菌生产重组蛋白A-EcoRI蛋白融合体。培养在恒浊器中进行，对第二罐进行热诱导，结果获得了比分批发酵高6倍的比生产率。研究者还尝试将生产重组蛋白的两级连续培养系统与亲和色谱柱相组合，试图实现重组蛋白生产和纯化的连续化。但由于技术上的一些原因，这种组合还未得到成功。

      比生长速率对细胞生长和产物形成均有重要作用。经常会遇到的情况是，最适于细胞生长的比生长速率却并不适于产物的形成或其它特性的实现。我们在培养面包酵母时发现，比生长速率为0.2 h-1时细胞产率最高，而比生长速率为0.178 h-1时酵母发酵活力最佳。针对这一现象我们提出了一个两阶段控制比生长速率的流加培养策略，结果在一个反应器中实现了高发酵活力与高细胞产率的统一。

(四)细胞循环发酵

       从反应器角度来考虑获得高细胞密度，通常采用的是细胞循环生物反应器。这种反应器利用一种切向流或中空纤维过滤器从醪液中分离细胞，细胞返回容器，无细胞醪液则以给定速率连续转移，同时代之以新鲜培养基。利用细胞循环技术，可使细胞保留在反应器中并达到高细胞密度，而毒性废产物和胞外产物则不断转移，这可以延迟或防止由细胞生长或产物形成引起的反馈抑制。细胞循环生物反应器能够适用于多种机体和生产系统，但它的应用也存在许多限制，主要包括∶(1)作用于进入过滤单元的细胞的剪应力太大；(2)系统的放大存在许多实际困难。

      操作细胞循环生物反应器时必须考虑两个因素，一是稀释率(流速／体积)；二是循环速率(指通过过滤系统的培养基速率)。稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同；高的循环速率可使组分混合均匀，特别适用于细胞容易凝聚或成团的情况。但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。

      细胞循环技术可望获得高的体积生产率，这对产物的提取非常有利。近年来循环发酵技术已广泛用于生产细胞代谢物，如燃料酒精和有机酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用细胞循环发酵技术，重组大肠杆菌细胞干重达到145 g/L，其重组青霉素酰化酶生产率比分批培养提高了近10倍。对于活细胞即为所希望的产物的培养，细胞循环发酵也能发挥作用。如在食品工业中，为生产牛奶，奶酪和酸乳酪需培养不同的乳杆菌，采用细胞循环生物反应器可以很容易地提高这些生物体的的密度。