杆状病毒滴度检测

录入时间:2010-5-26 15:54:35 来源：易生物

实验目的：检测病毒滴度

实验原理：根据噬菌斑数计算病毒滴度

材料与试剂：

1、6孔板，12ml离心管，100ml无菌玻璃瓶，无菌吸管，70℃水浴锅，无菌水

2、杆状病毒， SF9：5×10⁵cells/ml

3、4% agarose gel：2g agrose + 50ml 水，高压灭菌

4、2×Grace（unsupplemented）：9.14g粉末（invitrogen）+0.07gNaHCO₃+H₂O，调PH6.1，定容至100ml，无菌过滤

5、supplemented Grace：1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin，3.33mg/ml yeastolate，无菌过滤

6、高温灭活FBS

方法：

1、无菌条件下，2ml/孔细胞（5×10⁵cells/ml）种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度

2、将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解，空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热

3、将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释：10^-1~10^-8

4、弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔，复孔，室温孵育1h

6、配置上层琼脂：加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml，25ml 2×Grace（含FBS）+12.5ml 无菌水+12.5ml 4% agarose gel，至预热的100ml无菌瓶，轻轻混匀，放入37℃水浴锅备用

7、弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10-20min使其凝固

8、将6孔板放入27℃培养箱，培养4－10天

9、计数板中噬菌斑，直至连续两天无变化，加1mg/ml中性红0.5ml，室温孵育2h后计数噬菌斑

注：

病毒滴度（pfu/ml）=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积

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