农药残留——丁嘧脲检测方法

1．分析目标化合物

    丁嘧脲, 丁嘧脲尿素体, 丁嘧脲甲烷亚氨基酰胺体

2．仪器设备

    带碱热离子检测器或高灵敏度氮磷检测器的气相色谱仪、带紫外分光光度检测器的高效液相色谱仪、气相色谱-质谱仪和液相色谱-质谱仪。

3．试剂
 
    L-半胱氨酸盐酸盐溶液

   碳酸钾溶液

   乙腈

   2％二甘醇丙酮溶液

   乙醚

   正己烷

    0.1mol/L 乙酸缓冲溶液(pH5.0)：在0.1mol/L乙酸钠溶液中加入0.1mol/L乙酸溶液，调整pH5.0。
    丁嘧脲标准溶液：在10.0mg丁嘧脲中加入乙腈至200mL，吸取其10mL，加入乙腈：水(9：1)混合溶液至100mL。

4．标准品

    丁嘧脲标准品：含丁嘧脲99％以上，熔点为145℃～148℃。
    1－特丁基－3－(2，6－二异丙基－4－苯氧基苯基)尿素(以下称“尿素体”。)标准品：含尿素体97％以上，熔点为180℃～181℃。
    1－特丁基－3－(2，6－二异丙基－4－苯氧基苯基)甲烷亚氨基酰胺(以下称“甲烷亚氨基酰胺体”。)标准品 ：含甲烷亚氨基酰胺体97％以上，熔点为126℃～127℃。

5．试验溶液的制备

a 丁嘧脲试验溶液
① 提取方法
（I）种子类
    将样品粉碎通过420μm的标准网筛后，称取其8.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和15mL 1mol/L碳酸钾溶液,放置2小时。
    加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
    将样品搅碎后，称取其20.0g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液、10mL 1mol/L碳酸钾溶液和80mL乙腈，搅拌1分钟后，振荡30分钟，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中。滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
    样品粉碎后，称取其5.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和10mL 1mol/L碳酸钾溶液, 放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 净化方法
（I）种子类、水果和蔬菜
    在用铝箔包裹避光的环已基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈，准确至4mL，此为试验溶液。
（II）茶
    在用铝箔包裹避光的环已基甲硅烷基化硅胶小柱(2,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。再注入15mL乙腈：水(4：1)混合溶液，收集流出液。加入15mL水。
    氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)下面连接环已基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)。注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。注入上述溶液后，弃去流出液。再注入10mL乙腈：水 (2：3) 混合溶液，弃去流出液。取下弃去氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱。环已基甲硅烷基化硅胶小柱中注入10mL乙腈：水(1：1)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈，准确至4mL，此为试验溶液。
b 尿素体试验溶液
① 提取方法
（I）种子类
    将样品粉碎通过420μm的标准网筛后，称取其8.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和15mL 1mol/L碳酸钾溶液,放置2小时。
    加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
    将样品搅碎后，称取其20.0g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液、10mL 1mol/L碳酸钾溶液和80 mL乙腈，搅拌1分钟后，振荡30分钟，用玻璃纤维滤纸抽滤至200mL棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角烧瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
    样品粉碎后，称取其5.00g于300mL具塞的棕色三角烧瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和10mL 1mol/L碳酸钾溶液, 放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 净化方法
（I）种子类
    在用铝箔包裹避光的环已基甲硅烷基化硅胶小柱(1,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈至4mL。移取3mL溶液于棕色磨口减压浓缩器中，加入0.5mL 2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。残留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
    硅胶小柱(避光，690mg)中注入5mL正己烷，弃去流出液。柱中注入上述溶液，弃去流出液。注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液，弃去流出液。在此柱的下部先注入5mL正己烷，弃去流出液，连接氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(360mg)。硅胶小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷，残留物中加入乙腈溶解，准确至2mL，做为试验溶液。试验溶液制备后必须立即测定。
（II）水果和蔬菜
    环已基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光、1,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。再注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，弃去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈至4mL。移取2mL溶液于棕色磨口减压浓缩器中，加入0.5mL2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。残留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
    硅胶小柱(避光690mg)中注入5mL正己烷，弃去流出液。在柱中注入上述溶液，弃去流出液，注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合液，弃去流出液。此柱的下部连接预先注入5mL正己烷，弃去流出液的氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(360mg)。硅胶小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。残留物中加入乙腈溶解，准确至2mL，此为试验溶液。试验溶液制备后必须立即测定。
（III）茶
     环已基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光、2,000mg)中注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入10mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合液，弃去流出液。再注入15mL乙腈：水(4：1)混合液，收集流出液，加入15mL水。
     氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光，1,000mg)下面连接环已基甲硅烷基化硅胶小柱(遮光1,000mg)。注入乙腈10mL，弃去流出液。再注入水10mL，弃去流出液。柱中注入上述溶液后，弃去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3) 混合溶液，弃去流出液后，取下弃去氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱。环已基甲硅烷基化硅胶小柱中注入10mL乙腈：水(1：1)混合溶液，弃去流出液。再注入4mL乙腈，收集流出液于具刻度的棕色玻璃试管中，加入乙腈，准确至4mL。移取2mL溶液于棕色磨口减压浓缩器中，加入0.5mL 2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。残留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
    硅胶小柱(遮光、690mg)中注入5mL正己烷，弃去流出液。柱中注入上述溶液，弃去流出液。注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液，弃去流出液。此柱的下部连接预先注入5mL正己烷，弃去流出液的氨基丙基甲硅烷基化硅胶小柱(360mg)。硅胶小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。残留物中加入乙腈溶解，准确至2mL，此为试验溶液。试验溶液制备后必须立即测定。
c 甲烷亚氨基酰胺体试验溶液
① 提取方法
（I）种子类
    将样品粉碎通过420μm的标准网筛后，称取其8.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和15mL 1mol/L碳酸钾溶液,放置2小时。
    加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
    将样品搅碎后，称取其20.0g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液、10mL 1mol/L碳酸钾溶液和80mL乙腈，搅拌1分钟后，振荡30分钟，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
    样品粉碎后，称取其5.00g于300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸盐酸盐溶液和10mL 1mol/L碳酸钾溶液, 放置2小时。
加入80mL乙腈，振摇30分钟后，用玻璃纤维滤纸抽滤至棕色三角瓶中，滤纸上的残留物中加入30mL乙腈洗涤，合并洗液于棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 净化方法
    在十八烷基甲硅烷基化硅胶小柱(避光1，000mg)中注入10mL乙腈,弃去流出液。再注入30mL水，弃去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液后，弃去流出液。注入30mL水，弃去流出液。注入10mL乙腈，弃去流出液。再注入20mL乙腈：0.1mol/L乙酸缓冲溶液(pH5.0) (4：1)的混合溶液,收集流出液于100mL三角瓶中。 
    流出液中加入100mL 5％氯化钠溶液,再用50mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液移入200mL分液漏斗中, 用振荡器激烈振荡5分钟后，静置，乙酸乙酯和正己烷层移入200mL三角瓶中。水层中加入50mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液，按上述同样方法操作，合并乙酸乙酯和正己烷层于上述三角瓶中。加入适量无水硫酸钠，不时振荡、混合，放置15分钟后，滤入磨口减压浓缩器中。再用20mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液洗涤三角瓶，以此洗涤液洗涤滤纸上的残留物，重复操作二次，合并二洗涤液于减压浓缩器中，加入0.5mL2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙酸乙酯和正己烷。残留物中加入丙酮溶解，准确至3mL，此为试验溶液。

6．操作方法

a 定性试验
① 丁嘧脲试验
    用带紫外分光光度检测器的高效液相色谱仪，按下列操作条件进行试验。试验结果必须与丁嘧脲标准溶液的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm，细孔径30nm)。
柱：内径6mm，长150mm不锈钢管。
柱温： 40℃
检测器：波长256nm。
流动相：乙腈：水：甲醇(2：2：1)混合溶液。调整流速使丁嘧脲约32分钟流出。
② 尿素体试验
    用带紫外分光光度检测器的高效液相色谱仪，按下列操作条件进行试验。试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm)。
柱：内径6mm，长150mm不锈钢管。
柱温： 40℃
检测器：波长235nm。
流动相：乙腈：水：甲醇(2：2：1)混合溶液。调整流速使尿素体约20分钟流出。
③甲烷亚氨基酰胺体试验 
    用带碱热离子检测器或高灵敏度氮磷检测器的气相色谱仪，按下列操作条件进行试验。试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱：内径0.25mm、长30m的石英毛细管，涂布0.25μm厚气相色谱用50%苯基--甲基硅酮，老化。
柱温：在100℃保持1分钟，此后每分钟升温30℃。达到280℃后保持4分钟。
进样器温度：250℃ 
检测器温度：280℃ 
气体流量：以氦气为载气。调整流速使甲烷亚氨基酰胺体约10分钟流出。调节空气和氢气的流量至适当条件。
b 定量试验
    根据与a 定性试验相同操作条件所得试验结果，用峰高法或峰面积法对丁嘧脲、尿素体和甲烷亚氨基酰胺体进行定量，求出各含量，按下式求出包括尿素体和甲烷亚氨基酰胺体的的丁嘧脲含量。
丁嘧脲的含量(包适尿素体和甲烷亚氨基酰胺体)＝A＋B×1.04＋C×1.09
A：丁嘧脲的含量(mg/kg)
B：尿素体的含量(mg/kg)
C：甲烷亚氨基酰胺体的含量(mg/kg)
c 确证试验
    对于丁嘧脲和尿素体的试验溶液，按照与a 定性试验相同的操作条件，用液相色谱--质谱仪测定。试验结果必须与标准品的一致。此外，必要时用峰高法和峰面积法进行定量。
    对于甲烷亚氨基酰胺体的试验溶液，按照与a 定性试验相同的操作条件，用气相色谱--质谱仪测定。试验结果必须与标准品的一致。此外，必要时用峰高法和峰面积法进行定量。

7．定量限   
 
    水果和蔬菜：0.02 mg/kg，种子：0.04 mg/kg，茶：0.2 mg/kg

8．注意事项

1）分析值
    对丁嘧脲、尿素体和甲烷亚氨基酰胺体分别进行定量，将尿素体和甲烷亚氨基酰胺体含量乘以系数换算成丁嘧脲的含量。它们的和为丁嘧脲分析值。
2）丁嘧脲在光和水中非常不稳定，试验必须始终在避光条件下进行，严禁使用旋转蒸发仪。此外，不需磨碎、切细的冷冻保存样品解冻后，不能作为再度试验的样品。因磨碎样品中经常加重丁嘧脲的分解，提取前直接进行均质。尿素体和甲烷亚氨基酰胺体的试验溶液稳定。对于丁嘧脲的试验溶液不稳定的作物，配制后保存在冷冻库中，最好迅速测定。

附：丁嘧脲尿素体〔1－特丁基－3－（2,6－二异丙基－4－苯氧基苯基）尿素〕