动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法-微生物法

农业部于 2003 年 1 月 22 日发布第 236 号公告，发布12 个动物性食品中兽药残留检测方法。方法之十二：动物性食品中青霉素类抗生素残留检测方法———微生物法。

1 　范 围

本标准规定了动物性食品中青霉素类抗生素残留的微生物学检测方法。

本标准适用于牛奶中青霉素类抗生素的残留筛选检测。

2 　规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/ T1. 1 - 20001标准化工作导则第 1 部分：标准的结构和编写规则( ISO/ IEC Directives , Part3 , 1997 , Rules for the st ructure and draf ting of In2ternational Standards , NEQ)

中华人民共和国兽药典二○○○年版

GB/ T 6682 - 1992分析实验室用水规则和试验方法

N Y/ T ××××- 2001动物源食品中兽药残留检测方法标准编写规则

农牧发[1999 ]17号动物性食品中兽药最高残留限量

3 　制 样

3. 1 　样品的制备 　 取适量冷冻的空白或供试牛奶，于 30 ℃水浴中解冻。

3. 2 　样品的保存 　- 20 ℃以下冰箱中贮存备用。

4 　测定方法

4. 1 　方法提要或原理 　试料中残留的青霉素类抗生素，以嗜热脂肪芽孢杆菌为检定菌，采用微生物学圆纸片筛选法定性测定。当检定菌生长时，由于产酸而使培养基的颜色由紫色变为黄色。细菌被抑制的区域，无酸产生，培养基仍为紫色。本试验用青霉素酶区分耐青霉素酶的抗生素和不耐青霉素酶的青霉素类抗生素。

4. 2 　试剂和材料 　以下所用试剂，除特别注明者外，均为分析纯试剂，水为符合《中华人民共和国兽药典》二○○○年版规定的纯化水。

4. 2. 1 　青霉素标准品

4. 2. 2 　嗜热脂肪芽孢杆菌 ( Baci l l us sterothermophi l us) ATCC 10149 　经斜面培养基(见附录 A.1)每月传代一次 ,置 2～8 ℃冰箱中保存。

4. 2. 3 　青霉素酶 　 不得少于 200 万单位/ mL

4. 2. 4 　磷酸氢二钾

4. 2. 5 　磷酸二氢钾

4. 2. 6 　胨 　 生化试剂

4. 2. 7 　大豆蛋白胨 　 生化试剂

4. 2. 8 　胰蛋白胨 　 生化试剂

4. 2. 9 　牛肉浸出膏 　 生化试剂

4. 2. 10 　葡萄糖

4. 2. 11 　氯化钠

4. 2. 12 　吐温 – 80

4. 2. 13 　溴甲酚紫

4. 2. 14 　琼脂 　 生化试剂

4. 2. 15 　菌悬液的制备 　 将菌种接种至斜面培养基上，置(55 ±2) ℃培养 24 h 后，接种到繁殖培养基(见附录A. 2) 150 mL 中，于(55 ±2) ℃培养72 h ,当有80 %芽孢形成时，停止培养。培养液5 000 r/ min离心 15 min ,弃上清液;将沉淀物悬浮于灭菌生理盐水中，振摇，离心，弃上清液，重复洗涤3 次。将洗涤过的芽孢悬浮于灭菌生理盐水20 mL中，置2～8℃冰箱保存，可使用6个月。

将菌种接种至斜面培养基上，置(55 ±2) ℃培养7 d后，镜检，应有芽孢85 %以上。用灭菌生理盐水7 mL将芽孢洗下，在(65 ±2)℃加热30 min ,备用。置 2～8 ℃冰箱保存 ,可使用 3 个月。

4. 2. 16 　青霉素标准储备液 　取青霉素标准品适量，精密称定，用磷酸盐缓冲液 (pH 8. 0) 制成1 000μg/ mL的标准储备液。置2～8℃冰箱保存，有效期3 d。

4. 2. 17 　磷酸盐缓冲液(pH 8. 0) 　取磷酸二氢钾2g与磷酸氢二钾8g，加水使溶解成1 000 mL，滤过，分装，115℃灭菌30 min。

4. 3 　仪器与设备

4. 3. 1 　圆滤纸片 　 直径13 mm

4. 3. 2 　平底双碟 　 直径约90 mm ,高16～17 mm

4. 3. 3 　游标卡尺(精度0. 02 mm)或抑菌圈测定仪

4. 3. 4 　恒温培养箱

4. 3. 5 　微量移液器

4. 3. 6 　显微镜

4. 3. 7 　镊子

4. 3. 8 　电热恒温水浴锅

4. 3. 9 　分析天平 　 感量 0. 000 01 g

4. 3. 10 　天平 　 感量 0. 01 g

4. 4 　测定步骤

4. 4. 1 　试料的制备 　 试料的制备包括:

———取供试样品，作为供试试料。

———取空白样品，作为空白试料。

———取空白样品，将青霉素标准储备液稀释成10 ng/ mL 的溶液，作为空白添加试料。

———取供试样品适量，按每1mL计加青霉素酶0. 10 mL ,在(37 ±2)℃培养30 min ,作为判定试验试料。

4. 4. 2 　样品处理 　 取试料适量，(82 ±2)℃水浴加热 2 min ,冷却后，作为试样溶液，供微生物法测定。

4. 4. 3 　双碟的制备 　将检定培养基(见附录 A. 3)融化 ,置水浴中冷却至 55～64 ℃,加入菌悬液(每100 mL培养基加0. 6～0. 8 mL )，摇匀，吸取6. 0 mL置平皿中，使其均匀摊布，待凝固15 min后备用。

4. 4. 4 　测定 　 每个双碟中放置5 个圆滤纸片，每个滤纸片间距 10 mm 以上 ,用镊子轻压纸片，使纸片与培养基紧密接触，用微量移液器分别在5个滤纸片上加空白添加试料、空白试料、磷酸盐缓冲液(pH8. 0)、判定试验试料、供试试料各90μL。每个试料至少重复2个双碟，置(55 ±2)℃培养箱中培养5～6 h。

4. 5 　结果判定 　供试试料中无抑菌圈，为阴性反应。供试试料中有大于空白添加试料的抑菌圈，但在判定试验试料中无抑菌圈，为含不耐青霉素酶的青霉素类抗生素残留的阳性反应。判定试验试料和供试试料中有同等大小抑菌圈，为含其他抑菌物、不含不耐青霉素酶的青霉素类抗生素残留的阳性反应。供试试料中有抑菌圈，但判定试验试料中的抑菌圈远小于供试试料中的抑菌圈，为既含其他抑菌物又含不耐青霉素酶的青霉素类抗生素残留的阳性

反应。

5 　检测方法灵敏度

本方法在牛奶中的检测限为 4μg/ kg。

附录 A(规范性附录) 　培养基的配制

A. 1 　斜面琼脂培养基

胨5 g ,酵母浸膏2 g ,牛肉浸膏1 g ,氯化钠5 g ,琼脂15 g ,水1 000 mL。除琼脂外，混合上述成分，调节 pH值使其比最终的pH值略高 0. 2～0. 4 ,加入琼脂 ,加热溶化后滤过，调节pH 值使灭菌后为7. 4 ±0. 1，分装，115℃灭菌 30 min ,趁热斜放使凝固成斜面。

A. 2 　繁殖培养基

酵母浸膏 1 g ,胰蛋白胨 2 g ,葡萄糖0. 05 g ,水100 mL。混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7. 2 ±0. 2 ,分装 ,115℃灭菌30 min。

A. 3 　检定培养基

牛肉浸膏3 g ,蛋白胨5 g，胰蛋白胨1. 7 g，大豆蛋白胨 0. 3 g ，葡萄糖 5. 25 g，氯化钠 0. 5 g，磷酸氢二钾 0. 25 g，吐温 - 80 1 g，溴甲酚紫0. 06 g，琼脂15 g，水 1 000 mL。混合上述成分，调节pH值使灭菌后为7. 8 ±0. 2 ,分装 ,115℃灭菌15 min。